饲粮蛋白质水平对意大利蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响

袁　安　郭亚惠　吴小波　黄　晓　廖春华

(江西农业大学蜜蜂研究所，南昌330045)



饲粮蛋白质水平对意大利蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响

袁安郭亚惠吴小波*黄晓廖春华

(江西农业大学蜜蜂研究所，南昌330045)

摘要：本试验旨在研究饲粮蛋白质水平对意大利蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响。选择9群群势相当的本地意大利蜜蜂，随机分为3组，每组3群。Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组分别饲喂蛋白质水平为15%、25%、35%的试验饲粮。饲喂45 d后，测定采集蜂分别在1 000、2 000 m处的回归率及不同日龄(刚出房、10日龄、20日龄)工蜂3个记忆相关基因[谷氨酸受体A型基因(GluRA)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1型基因(Nmdar1)、酪胺受体1型基因(Tyr1)]的表达情况。结果表明：Ⅱ组和Ⅲ组蜜蜂在1 000、2 000 m处的回归率均显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)；Ⅲ组10和20日龄工蜂的GluRA相对表达量显著高于Ⅱ组和Ⅰ组(P<0.05)，且Ⅱ组工蜂的GluRA相对表达量也显著高于Ⅰ组(P<0.05)；Ⅱ组和Ⅲ组10和20日龄工蜂的Nmdar1相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)；Ⅱ组和Ⅲ组10日龄工蜂的Tyr1相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)；各试验组刚出房工蜂的GluRA、Nmdar1、Tyr1以及20日龄工蜂的Tyr1相对表达量差异均不显著(P>0.05)。由此得出，饲粮蛋白质水平过低会影响意大利蜜蜂的归巢能力及记忆相关基因的表达。

关键词：意大利蜜蜂；蛋白质水平；回归率；记忆基因

蜜蜂是一种典型的社会性经济昆虫，属于节肢动物门(Arthropoda)，昆虫纲(Insecta)，膜翅目(Hymenoptera)，蜜蜂总科(Apoidea)，蜜蜂科(Apidae)，蜜蜂属(Apis)[1]，其作为生态系统中的重要成员，对生物多样性的促进和生态平衡的维持具有重要意义。但自从2006年冬季以来，蜂群崩溃失调病(colony collapse disorder，CCD)席卷了美国、法国、瑞典、德国和澳大利亚等国，致使当地蜂农蜂群损失达50%～90%。CCD的症状为蜂群中大量的成年工蜂短时间内突然消失在巢外，没有发现尸体，只剩下蜂王、卵、一些未成年的工蜂和大量蜜粉残留于巢脾里。诱发CCD的因素可能是疾病、农药、气候、营养等[2-4]，但还没有确定的答案。营养可能是CCD发生的主要因素之一，营养不良会影响蜜蜂的机体发育，甚至影响蜜蜂的归巢能力和记忆相关基因的表达，从而导致蜜蜂迷失方向并消失在巢外。但关于蜜蜂学习记忆相关基因表达的报道较少，科研人员通过克隆等试验推测西方蜜蜂的酪胺受体(tyramine receptor)1型基因(Tyr1)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor)1型基因(Nmdar1)以及谷氨酸受体(glutamate receptor)A型基因(GluRA)是参与西方蜜蜂学习记忆的重要基因[5-7]。近年来，蜜蜂蛋白质营养需要研究取得了阶段性成果，研究发现饲粮蛋白质水平会影响卵的孵化率、幼虫化蛹率和机体抗氧化活性等[8-12]，但还没有关于饲粮蛋白质水平是否会影响蜜蜂的归巢能力及记忆相关基因表达的报道。基于此，本试验拟研究饲粮蛋白质水平对蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响，为探索CCD致病因素提供一些依据。

1材料与方法

1.1试验动物

试验动物为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的本地意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)，简称意蜂。

1.2主要试剂及器材

1.3试验设计

1.3.1蜂群的选择与饲养管理

选取群势相当的本地意大利蜜蜂(群内无花粉脾)9群，随机分为3组，每组设3个重复。试验开始前将各试验组蜂群群势调整至5足框，之后每组分别饲喂蛋白质水平为15%、25%、35%的试验饲粮，具体饲粮配方参照文献[10]。因试验期间外界有粉源，所以整个试验期间试验蜂群安装脱粉器，并奖励饲喂糖水。将3种不同蛋白质水平的人工配合饲料分别按人工配合饲料∶糖∶蜜=2∶3∶1的比例混匀后加入适量水，反复揉搓，直到攥成团状为止。将饲粮制成饼状，每群每次饲喂400 g，放置在梁框上供蜜蜂采食，每3 d更换1次饲粮。连续饲喂45 d后进行后期的检测试验。

1.3.2饲粮蛋白质水平对采集蜂归巢能力的影响

用吸蜂机在巢门口抓取带花粉的采集蜂，参照何旭江[13]的试验方法对采集蜂进行电子标记，利用GPS全球定位仪分别在距离蜂巢1 000、2 000 m处进行精确定位，将带标签且采食足量糖水的蜜蜂带至目的地点放飞，利用蜜蜂RFID记录系统对其回巢情况进行记录，重复6次。

放飞蜜蜂有效数：在5 min之内蜜蜂起飞归巢的数量，剔除未能进行正常飞行的蜜蜂。

回归率=回巢蜜蜂数/放飞蜜蜂有效数。

1.3.3饲粮蛋白质水平对工蜂记忆相关基因相对表达量的影响

1.3.3.1样品采集

采取每群刚出房、10日龄和20日龄工蜂各20只，分别装入1.5 mL RNase-free的EP管，迅速放入液氮中，用于后续检测。

1.3.3.2RNA的提取与cDNA的合成

取3只同一蜂群、同一日龄的蜜蜂头部混合为1个样品，放入含液氮的研钵内，研磨至粉末状后移置加有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中。参考秦秋红[14]试验方法对样本RNA进行提取。最后所得总RNA通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。用核酸蛋白测定仪测定260和280 nm处吸光度值(OD)，计算二者的比值(OD260/280)(1.9～2.1之间符合标准)，每个样品测定3次，取平均值。

用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反应体系为50 μL，包含：8 μL总RNA，10 μL Buffer，8 μL dNTP Mixture，1.5 μL M-MLV，3 μL Oligo(dT)，1 μL RNA酶抑制剂，18.5 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水。反转录反应条件如下：体系混匀后，42 ℃反应60 min，75 ℃灭活5 min。反转录产物保存于-80 ℃。

1.3.3.3荧光定量PCR引物的设计及荧光定量PCR

根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上所示西方蜜蜂基因组序列，用Primer 5.0软件设计引物序列(表1)。因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)在蜜蜂发育过程中表达较稳定[15]，所以本试验以GAPDH作为内参基因。

表1　荧光定量PCR引物序列

1.4数据处理

采用StatView软件“ANOVA andt-test”中的“ANOVA or ANCOVA”对试验数据进行统计分析。

2结果

2.1饲粮蛋白质水平对采集蜂归巢能力的影响

由表2可知，Ⅱ组和Ⅲ组采集蜂在1 000、2 000 m处的回归率均显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。

表2　饲粮蛋白质水平对意大利蜜蜂回归率的影响

同行数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Values in the same row with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2饲粮蛋白质水平对工蜂GluRA相对表达量的影响

试验结果如图1所示。各试验组刚出房工蜂的GluRA相对表达量差异不显著(P>0.05)。Ⅲ组10和20日龄工蜂的GluRA相对表达量显著高于Ⅱ组和Ⅰ组(P<0.05)，同时Ⅱ组也显著高于Ⅰ组(P<0.05)。

2.3饲粮蛋白质水平对工蜂Nmdar1相对表达量的影响

试验结果如图2所示。各试验组刚出房工蜂的Nmdar1相对表达量差异不显著(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组10和20日龄工蜂的Nmdar1相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。

2.4饲粮蛋白质水平对工蜂Tyr1相对表达量的影响

试验结果如图3所示。各试验组刚出房和20日龄工蜂的Tyr1相对表达量差异均不显著(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组10日龄工蜂的Tyr1相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著(P>0.05)。

数据柱标注相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)；图A、B、C分别表示为刚出房工蜂、10日龄工蜂、20日龄工蜂。下图同。

Date columns with the same letters mean no significant difference (P>0.05), while with different letters mean significant difference (P<0.05); the figures of A, B, C mean newly emerged bee, 10-day-old bee and 20-day-old bee. The same as below.

图1饲粮蛋白质水平对工蜂GluRA相对表达量的影响

Fig.1Effects of dietary protein level on the relative expression level ofGluRAof worker bees

图2　饲粮蛋白质水平对工蜂Nmdar1相对表达量的影响

图3　饲粮蛋白质水平对工蜂Tyr1相对表达量的影响

3讨论

蜜蜂是一种全变态昆虫，个体发育要经过卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段，其中幼虫阶段和成虫阶段需要进食、消化与吸收营养食物。成虫阶段蜜蜂(工蜂)进食的天然食物主要是花粉和蜂蜜。幼虫阶段的前期主要由工蜂分泌蜂王浆进行饲喂，其蜂王浆的营养成分与工蜂进食的食物有关。幼虫阶段的后期由工蜂饲喂蜂粮，即花粉和蜂蜜的混合发酵物。然而，在外界缺少蜜粉源的早春，养蜂生产者常常使用花粉代用品(蛋白质饲粮)和糖水。不同蛋白质水平的花粉代用品对蜜蜂个体体重、咽下腺发育以及抗氧化性能具有明显的影响[8-12]，从而影响着蜂群的群势和产浆性能等。本试验发现，Ⅱ组和Ⅲ组采集蜂在1 000、2 000 m处的回归率均显著高于Ⅰ组，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著。这说明蜜蜂饲粮中蛋白质水平过低会影响采集蜂的归巢能力。其主要原因在于刚出生的工蜂在后期发育时需要大量蛋白质来使自身机体进一步发育成熟，过低的蛋白质水平会影响工蜂的后期发育，从而使其生理机能下降，导致其归巢能力降低。

GluRA广泛存在于中枢神经系统内，在西方蜜蜂中被认为是一种促代谢性的谷氨酸受体基因，并影响着蜜蜂的长期学习记忆能力，是蜜蜂学习记忆生理过程的关键神经递质[7]。本试验发现，Ⅲ组10和20日龄工蜂的GluRA相对表达量均显著高于Ⅱ组和Ⅰ组，且Ⅱ组10和20日龄工蜂的GluRA相对表达量也显著高于Ⅰ组。这说明饲粮蛋白质水平显著影响10和20日龄工蜂的GluRA的表达。工蜂刚出房后需要采集高蛋白质水平饲粮使其自身内部器官得到进一步发育，从而完善其机体机能，特别是为了后期采集花粉、花蜜，需要良好的长期记忆能力，从而提高采集归巢能力。

Nmdar1与西方蜜蜂学习记忆有关，并广泛存于蜜蜂大脑的蘑菇体凯恩细胞和其他神经器官中[6]。本试验发现，Ⅱ组和Ⅲ组10和20日龄工蜂的Nmdar1相对表达量显著高于Ⅰ组，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著。这说明饲粮蛋白质水平过低影响着工蜂脑部神经器官的发育，从而降低了记忆相关基因的表达，进而影响蜜蜂的归巢能力，这与蜜蜂放飞归巢试验结果一致。

Tyr1是昆虫体内重要的神经递质，调控昆虫飞行以及学习与记忆等生理行为[16-17]，也是一种参与西方蜜蜂学习记忆的重要基因[5]。本试验发现，Ⅱ组和Ⅲ组10日龄工蜂的Tyr1相对表达量显著高于Ⅰ组，但Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著。这说明不同蛋白质水平饲粮对工蜂Tyr1表达有一定的影响，过低的蛋白质水平影响着工蜂的记忆能力。然而，饲粮蛋白质水平对20日龄工蜂的Tyr1相对表达量的影响不显著，主要原因可能是Tyr1与调节蜜蜂短时记忆有关，如蜜蜂认巢试飞，而与蜜蜂采集时的长期记忆无关。何旭江[13]研究发现，蜜蜂的首次认巢认飞活动主要集中在7～11日龄，即此日龄段需要较高的Tyr1，具体原因有待于进一步研究与分析。

另外，本试验还发现，刚出房工蜂的GluRA、Nmdar1和Tyr1相对表达量各试验组之间差异不显著，可能是因为工蜂采食不同蛋白质水平饲粮后，其分泌的蜂王浆中的一些主要活性因子差异不显著，如10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA，又称王浆酸)[18]，对蜜蜂幼虫发育影响较小，具体原因有待于进一步深入研究。

4结论

饲粮蛋白质水平影响意大利蜜蜂记忆相关基因的表达，进而影响其归巢能力。在日常饲喂蜂群时，饲粮蛋白质水平不应低于25%。

致谢：

感谢山东农业大学胥保华教授团队提供试验蛋白质饲粮！

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(责任编辑菅景颖)

Effects of Dietary Protein Level on Homing Capability and Memory Related Gene Expression ofApismelliferaligustica

YUAN AnGUO YahuiWU Xiaobo*HUANG XiaoLIAO Chunhua

(Honeybee Research Institute, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Abstract:The objective of this experiment was to explore the effects of dietary protein level on homing capability and memory related gene expression of Apis mellifera ligustica. Nine colonies of local Apis mellifera ligustica with equal colony population were randomly divided into 3 groups with 3 replicates in each group. Bees in groups Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were fed diets containing 15%, 25%, 35% protein, respectively. In this study, the homing rate of foragers in the 1 and 2 km away after feeding 45 days and the expression levels of three memory related genes [glutamate receptor type A gene (GluRA), N-methyl-D-aspartic acid receptor type 1 gene(Nmdar1) and tyramine receptor type 1 gene (Tyr1)] in different day-old (newly emerged, 10-day-old and 20-day-old) worker bees were detected. The results showed that the homing rates in the 1 and 2 km away in groups Ⅱ and Ⅲ were significantly higher than those in group Ⅰ (P<0.05), while there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). The expression level of GluRA of 10-day-old and 20-day-old worker bees in group Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ and Ⅱ (P<0.05), and that in group Ⅱ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05). The expression level of Nmdar1 of 10-day-old and 20-day-old worker bees in groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), but there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). The expression level of Tyr1 of 10-day-old worker bees in groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than that in group Ⅰ (P<0.05), but there was no significant difference between groups Ⅱ and Ⅲ (P>0.05). Besides that, there were no significant differences in the expression levels of GluRA, Nmdar1 and Tyr1 of newly emerged worker bees among the three groups (P>0.05), and the expression level of Tyr1 of 10-day-old worker bees among the three groups also had no significant difference (P>0.05). In conclusion, the lower level of protein in the diet may infect the homing ability and the expression of memory related genes of Apis mellifera ligustica.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：296-302]

Key words:Apis mellifera ligustica; protein level; homing rate; memory genes

*Corresponding author, associate professor, E-mail: wuxiaobo21@163.com

中图分类号：S894

文献标识码：A

文章编号：1006-267X(2016)01-0296-07

作者简介：袁安(1989—)，男，江西万载人，硕士研究生，从事养蜂学研究工作。E-mail: 1248215336@qq.com*通信作者：吴小波，副教授，E-mail: wuxiaobo21@163.com

基金项目：国家自然科学基金项目(31360587)

收稿日期：2015-09-15

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.038