一株耐氧耐酸碱高效异养硝化菌的筛选及其硝化特性研究

郝永利，王庆生

(1.环境保护部固体废物与化学品管理技术中心，北京 100029；2.中国环境科学研究院，北京 100012)



一株耐氧耐酸碱高效异养硝化菌的筛选及其硝化特性研究

郝永利1，王庆生2

(1.环境保护部固体废物与化学品管理技术中心，北京 100029；2.中国环境科学研究院，北京 100012)

摘要：通过专一性选择培养基，从活性污泥中筛选到一株高效异养硝化菌，并对菌株进行了鉴定及硝化特性研究。结果表明，筛选到的异养硝化菌株为芽胞杆菌属(Bacillus sp.)，命名为GL2。碳源、有机氮源、C/N、溶解氧及初始pH值均对菌株硝化特性有较大影响，在丁二酸钠为碳源、硫酸铵为氮源、C/N15、DO 3.8～8.5 mg/L及初始pH值为6～10、氨氮负荷为420 mg/L条件下，氨氮去除率达99.7%，显示出该菌株高效硝化能力。菌株兼具好氧反硝化特性，可实现单级反应器的同步硝化反硝化，具有潜在的工程废水处理应用价值。

关键词：异养硝化；筛选；16S rDNA序列；硝化特性；去除率

在垃圾渗滤液等高氨氮有机废水处理过程中，脱氮一直是处理的难点。生物脱氮因具有处理成本低、工艺调试简单等优点，已被广泛应用于各类高浓度有机废水脱氮工艺中。而异养硝化是一类异养微生物在有氧条件下进行硝化脱氮的过程，且异养硝化菌具有生长速度快、环境适应性强等优点[1-2]；因此，异养硝化作为生物脱氮新技术之一，引起了国内外相关研究者的广泛关注。

目前，一系列异养硝化菌被筛选出来，如木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)等[3-4]；但筛选出的异养硝化菌在实际硝化过程中存在生长活性差、生存能力弱及硝化效率低等问题，如H. Y. Zheng等[5]筛选出的菌株，在硝化反应过程中亚硝酸盐严重积累。另外，研究者们在对筛选出的异养硝化菌进行硝化特性研究时，多以无机氮源作为唯一氮源且氨氮起初负荷较低，因此上述菌株在处理高浓度有机废水时，其硝化效果存在很大的不确定性。本研究筛选出一株高效异养硝化菌，并对其硝化特性进行详实的研究，以期为垃圾渗滤液等高氨氮有机废水的脱氮处理提供理论支持和候选菌株。

1材料与方法

1.1菌株来源

菌株分离自垃圾渗滤液处理活性污泥。

1.2培养基

富集驯化培养基(L-1)：丁二酸钠·6H2O 23.85 g；(NH4)2SO42.0 g ；维氏盐溶液50 mL；pH=7.2。

异养硝化培养基(L-1)：同富集驯化培养基。

LB活化培养基(L-1)：蛋白胨 10 g；酵母浸膏 5 g；NaCl 5 g；pH=7。

维氏盐溶液(L-1)： K2HPO45.0 g； MgSO4·7H2O 2.5 g；NaCl 2.5 g； FeSO4·7H2O 0.05 g； MnSO4·H2O 0.05 g。

1.3异养硝化菌株的筛选

1.3.1菌株的富集、初筛

将5 mL打散的活性污泥转接至灭菌富集培养基中，经过一段时间的富集驯化培养之后，通过连续稀释以及平板划线纯化，然后将单菌落转接到斜面保存。

1.3.2斜面菌株复筛

将前期初筛菌株分别活化并转接到异养硝化培养基中进行摇床恒温培养，48 h后取样测定培养基的氨氮去除率，根据培养基中氨氮去除率确定复筛菌株。

1.4菌株形态学及理化特性

复筛菌株的形态学特征及其理化特性研究可参照文献[6-7]的方法实施。

1.5菌株16S rDNA序列分析

1.5.1基因组DNA的提取

基因组DNA的提取参考文献[8]中的CTAB法。

1.5.216S rDNA序列测序

以基因组DNA为模板扩增16S rDNA基因，采用通用引物，常规PCR反应体系进行扩增。PCR扩增产经纯化后外送测序。

1.5.3菌株系统发育分析

将测序得到的16S rDNA序列在National Center for Biotechnology Information中进行序列相似性比对，选取多株模式菌16S rDNA序列，使用MEGA软件进行多序列比对分析，并构建菌株系统发育树。

1.6异养硝化菌株GL2硝化特性研究

1.6.1碳源对菌株GL2硝化特性的影响

分别以乙酸钠、柠檬酸钠及丁二酸钠为培养基唯一碳源，设置碳氮比(C/N)为10，以体积比为1%的接种量接种到100 mL培养液中，置于30 ℃摇床培养，摇床转速为180 r/min。培养过程中每隔8 h取样测定培养基中pH值、OD600及氨氮浓度。

1.6.2C/N对菌株GL2硝化特性的影响

改变培养基中丁二酸钠的量，将C/N分别调整为2、4、8、10和15，以体积比为1%的接种量接种到培养液中，置于30 ℃摇床培养，摇床转速为180 r/min。取样及指标测定同1.6.1节。

1.6.3初始pH值对菌株GL2硝化特性的影响

将培养基中的pH值分别调整为5、6、8、9和10，以体积比为1%的接种量，将菌株转接至培养液中，置于30 ℃摇床培养，摇床转速为180 r/min。取样及指标测定同1.6.1节。

1.6.4DO对菌株GL2硝化特性的影响

分别设定摇床转速为100、140、180及220 r/min。对应DO分别为3.8、5.2、7.0及8.5 mg/L。将菌株以1%接种量接入培养液中，置于30 ℃摇床培养，取样及指标测定同1.6.1节。

1.6.5有机氮源对菌株GL2硝化特性的影响

在异养硝化培养基中分别添加1%的玉米浆、牛肉膏、蛋白胨以及酵母膏，以原异养硝化培养基作为对照，取样及指标测定同1.6.1节。

1.6.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

将菌株GL2转接至异养硝化培养基中，置于30 ℃摇床培养，摇床转速为180 r/min，培养24 h后取样，定量测定NH4+-N、NO2--N、NO3--N及羟胺浓度。

1.7分析方法[9-10]

本研究分析方法详见表 1。

表1　分析方法

2结果与讨论

2.1异养硝化菌株的筛选

通过对活性污泥连续数月的富集以及平板初筛，获得初筛菌株102株，将初筛菌株分别接入异养硝化液体培养基进行培养，经定量测定氨氮去除率，获得1株硝化效果最好的异养硝化菌株，编号GL2。选取该菌株进行后续硝化特性研究。

2.2菌株GL2形态学和理化特性

将菌株GL2在琼脂平板上培养48 h，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，部分菌落呈半透明，部分菌落呈不透明。菌株GL2的形态学特征如图1所示。观察细胞大小为(0.3～0.5)μm×(1.0～2.5)μm，其理化特性见表2。

图1　菌株GL2形态学特征

理化指标结果理化指标结果葡萄糖氧化+色氨酸脱氨酶-接触酶+精氨酸双水解酶-氧化酶+鸟氨酸脱羧酶-V-P+明胶液化+甲基红+Tween80-4℃生长+硫化氢+42℃生长+酪素水解+淀粉水解-吲哚-

注：表中“+”表示阳性；“-”表示阴性。

2.3菌株GL2系统发育分析

菌株GL2系统发育树如图2所示。将获得的GL2 16S rDNA序列在数据库EzTaxon server 2.1中进行比对，比对结果发现，菌株GL12的16S rDNA基因序列与Bacillus(属)中多数菌种的16S rDNA基因序列相似度>99%。其中与菌株Bacillus pumilus ATCC 7061(T)的16S rDNA基因序列的相似度达到99.9%，结合GL12形态学特征和理化特征，初步认定GL2属于Bacillus sp.，将其命名为Bacillus sp.GL2。

图2　菌株GL2系统发育树

2.4异养硝化菌株GL2硝化特性研究

2.4.1碳源对菌株GL2硝化特性的影响

在异养硝化过程中，碳源为微生物的生长提供能量及合成产物的碳架，对微生物硝化过程具有重要的影响[11]。结合国内外研究者针对异养硝化菌硝化所需碳源的选择，研究选取乙酸钠、丁二酸钠及柠檬酸钠等3种碳源进行菌株GL2异养硝化特性研究。碳源对菌株GL2硝化特性的影响如图3所示。由图3可知，3种碳源对GL2的生长及脱氮特性影响较大，柠檬酸钠和丁二酸钠能显著促进GL2的生长及氨氮的去除，且丁二酸钠效果好于柠檬酸钠，氨氮去除率分别达92.2%和88.1%。培养基的pH值也随着碳源的利用产生OH-而呈现不断升高的趋势。而在乙酸钠的培养基中则没有效果，甚至氨氮浓度反而有所上升，这与吴建江等[12]的研究结果类似，分析原因可能是前两类碳源作为速效碳源，大大有利于微生物相关代谢循环的进行，而底物乙酸钠不能够及时诱导菌株GL2产生相关代谢酶系，导致菌株不能进行正常的新陈代谢，出现老化裂解死亡，从而释放胞内氮，使培养基氨氮浓度升高。综上所述，在后续研究中应以丁二酸钠作为异养硝化培养基中唯一碳源。

图3　碳源对菌株GL2硝化特性的影响

2.4.2C/N对菌株GL2硝化特性的影响

相关研究表明，在菌株异养硝化过程中，培养基的碳氮比越高，菌株获得的能量越充足，菌株的生长及异养硝化活性越好[13]，研究异养硝化菌株GL2硝化反应所需的最适碳氮比对其在实际废水硝化脱氮应用中具有重要意义。碳氮比对菌株GL2生长及异养硝化特性的影响如图4所示。由图4可知，培养基中C/N比越高越有利于菌株GL2的生长，菌株异养硝化活性越高，同时培养基内pH值升高趋势也越显著。在C/N为2时，由于菌体生长所需碳源严重不足，导致菌体生长缓慢，同时培养基中pH值后期出现下降的现象，这可能是由于菌体自溶后，释放出胞内的酸性物质所致。随着培养基C/N的不断升高，菌株GL2的生长特性及异养硝化特性得以恢复并加强，尤其在C/N为15时，培养基中氨氮残留量仅为2.1 mg/L，氨氮去除率高达99.5%，无论在氨氮负荷耐受能力方面，还是在氨氮去除率方面，菌株GL2均优于目前分离出的绝大多数异养硝化菌[14-15]。垃圾渗滤液等高浓度有机废水的C/N一般均>15，因此，菌株GL2对于此类废水的脱氮处理具有很大的潜在应用价值。

图4　C/N对菌株GL2硝化特性的影响

2.4.3初始pH值对菌株GL2硝化特性的影响

环境中的pH能够影响微生物营养物质的可给性，同时也会影响到微生物细胞内代谢酶系的活性，对菌株生长和异养硝化过程有着较大的影响，菌株对pH值的适应性将会成为其能否进行高效脱氮反应的关键[16]。pH值对GL2异养硝化特性的影响如图5所示。当pH值为5时，GL2几乎不能进行生长及进行硝化反应，说明低pH值条件抑制了菌体诱导酶的合成，同时大大降低了菌体合成酶的活性，导致GL2既不能正常生长又不能进行硝化代谢。当pH值为6～10时，GL2能很好地生长并进行硝化反应，平均氨氮去除率>99.0%，最大的氨氮去除率高达99.7 %。而目前分离出的异养硝化菌大都只能在中性偏碱性的条件下才能进行较好的硝化反应，如李卫芬等[17]的研究表明，菌株F1在pH>8时就表现出菌株长势减弱、反硝化硝化效率降低的现象。吴建江等筛选出的异养硝化菌XS76虽然也能适应较宽的pH域，但是其氨氮去除率较低，最高为99.0%。GL2上述特性表明其具有较广的pH适应力，在pH值为6～10时，均可以进行快速生长脱氮，其pH耐受范围优于目前分离出的绝大多数异养硝化菌株。

图5　初始pH值对菌株GL2硝化特性的影响

2.4.4DO对菌株GL2硝化特性的影响

DO的大小直接影响菌株生长及代谢活性，在微生物生长环境中，DO过低或过高均会减缓或抑制菌体的生长[18-20]。本研究通过改变摇床转速来调节培养基中的DO。对菌株GL2硝化特性的影响如图6所示。由图6可知，在其他因素相同的条件下，当摇床转速越高，菌株生长及氨氮去除活性越高。当DO为3.8 mg/L时，GL2的生长及氨氮去除出现一定程度延迟，但当DO分别为5.2、7.0及8.5 mg/L时，菌株GL2的菌体密度、培养基pH值以及氨氮去除率相差无几，氨氮去除率均能达到99.0%以上，说明菌株GL2在一定范围内不受DO大小的影响，具有较好的DO耐受性；因此，在实际工程废水处理中，只要能够将DO值控制在5.2～8.5 mg/L，GL2就能够进行快速生长及高效硝化反应，缩短废水脱氮工艺的调试周期，节省调试投入成本。

图6　DO对菌株GL2硝化特性的影响

2.4.5有机氮源对菌株GL2硝化特性的影响

在垃圾渗滤液一类高浓度有机废水中，有机氮会在氨化细菌的作用下发生氨化反应，导致废水中氨氮浓度的升高。何霞等[21]研究发现，在菌株Bacillus sp. LY培养过程中，由于氨化反应产生的氨氮的量大于菌株LY利用量，导致氨氮浓度增加了98.0 mg/L。由图7可知，在GL2培养初期，蛋白胨和牛肉膏有机氮源组，尤其是蛋白胨有机氮源组氨化作用要显著强于硝化作用，因而对应培养基中的氨氮浓度迅速上升，而此后则主要通过异养硝化作用而使氨氮浓度不断下降，表明菌株的有机氮去除能力相对较强。且相比于无机氮源，GL2在有机氮源中生长更快，硝化活性更高。这表明GL2氮源底物利用范围较广，有利于高浓度废水脱氮处理应用。

图7 有机氮源对菌株GL2硝化特性的影响

2.4.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

目前，分离出的少数异养硝化菌具有好氧反硝化特性[22]。为考察菌株GL2是否具有好氧反硝化特性，本研究对菌株GL2进行了培养基氮素平衡的考察。由表3可知，GL2经过24 h的培养，被GL2同化吸收的氨氮约为57.7 %，同时通过GL2反硝化作用去除的氨氮约为40.7 %，反应末期硝酸盐氮积累仅约为2.8 mg/L。上述结果表明，异养硝化菌株GL2具有好氧反硝化特性，可实现单一反应器内同步硝化反硝化脱氮反应。

表3　菌株GL2的反硝化功能

3结语

综上所述，可以得出如下结论。

1)通过传统微生物学技术从活性污泥中筛选到1株高效异养硝化菌GL2，经过菌种鉴定，初步认定菌株GL2为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，命名为Bacillus sp.GL2。

2)碳源、C/N、溶解氧(DO)、初始pH值及有机氮源均对菌株硝化特性有较大影响，在丁二酸钠为碳源、硫酸铵为氮源、碳氮比为15、溶解氧为3.8～8.5 mg/L和pH值为6～10的条件下，氨氮去除率最高达99.7%，显示出该菌株耐氧耐酸碱的高效硝化能力。

3)菌株GL2经过24 h的培养，培养基中约40.7%的氮通过反硝化作用以气体的形式释放，具有同步硝化反硝化特性，可实现单一反应器内同步硝化反硝化脱氮反应，可作为实际废水硝化处理的备用菌源。

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责任编辑马彤

Research on Screening and Nitrification Characteristics of a Efficiently Heterotrophic Nitrifier Resistanting Oxygen, Acid and Alkali

HAO Yongli1, WANG Qingsheng2

(1.Solid Waste and Chemicals Management Center, MEP, Beijing 100029， China；2.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012， China)

Abstract：A heterotrophic nitrifier is isolated from the activated sludge of landfill leachate through specific select medium. It is identified as Bacillus sp. named as GL2. Its nitrification function is studied to show that the factors including carbon source, C/N, pH, DO and organic nitrogen are important for nitrification of strain GL2. The optimized condition for nitrification is as follows: sodium succinate as the carbon resource, C/N of 15, pH of 6-10, DO of 3.8-8.5 mg/Land the initial ammonia nitrogen of 420 mg/L. Combining these conditions, the removal rate of ammonia nitrogen reaches 99.7%. The strain has the capability to achieve aerobic denitrification. These results show that strain GL2 with highly effective heterotrophic nitrification could achieve simultaneous nitrification and denitrification.Hence, the strain GL2 could have high potential in practical wastewater treatment.

Key words:heterotrophic nitrification， screening， 16S rDNA sequence, nitrification characteristics， removal rate

收稿日期：2015-12-01

作者简介：郝永利(1976-)，男，工程师，硕士，主要从事固体废物及水污染防治技术研究及管理等方面的研究。

中图分类号：X 172

文献标志码:A