耐铜苏丹草根内生细菌的分离筛选及其生物学特性研究①

王 璐，何琳燕，盛下放

(农业部农业环境微生物实验室，南京农业大学生命科学学院，南京 210095)



耐铜苏丹草根内生细菌的分离筛选及其生物学特性研究①

王 璐，何琳燕，盛下放*

(农业部农业环境微生物实验室，南京农业大学生命科学学院，南京 210095)

摘 要：从生长在铜矿废弃地土壤中的Cu耐性苏丹草根中分离筛选到二株产1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶内生细菌K1-6和K3-9菌株，并对菌株生物学特性进行了研究。菌株K1-6和K3-9具有较强的Cu抗性和多种抗生素抗性，菌株K1-6和K3-9能够溶磷和分泌吲哚乙酸(IAA)，另外，菌株K3-9还能够产生铁载体和精氨酸脱羧酶，菌株K1-6和K3-9对温度、pH和盐浓度具有一定的耐受性，经16S rDNA序列分析，菌株K1-6和K3-9分别被鉴定为根瘤菌属(Rhizobium sp.K1-6)和肠杆菌属(Enterobacter aerogenes K3-9)。采用平皿培养试验研究了菌株K1-6和K3-9对生长在不同浓度Cu(0、4 mg/L)环境中的苏丹草的生长和吸收Cu的影响。结果表明，接菌处理苏丹草根部和地上部干重分别比对照增加了10.6%～45.5% 和13%～40%，差异达显著水平(P ＜ 0.05)；接菌株K1-6处理苏丹草根部和地上部Cu含量比对照增加了46% 和85%(P ＜ 0.05)，而接菌株K3-9处理苏丹草根部和地上部Cu含量与对照相比没有显著差异。另外，接菌株K1-6处理苏丹草根部和地上部总Cu吸收量比对照增加了88% 和114%(P ＜ 0.05)，接菌株K3-9处理苏丹草根部总Cu吸收量比对照增加了44%(P ＜ 0.05)。另外，接菌株K1-6和K3-9处理的苏丹草根部吸收的Cu是地上部吸收Cu的16～23倍。研究表明，分离自耐铜苏丹草根部的内生细菌具有多种植物促生特性，能够显著促进苏丹草的生长、提高苏丹草对Cu的耐受性，并强化苏丹草根部对Cu的富集能力。另外，不同的内生细菌对苏丹草的生长、富集和耐受Cu的影响不同。

关键词：铜矿废弃地；苏丹草；植物内生促生细菌；Rhizobium sp.K1-6；Enterobacter aerogenes K3-9

由于铜矿开采和提炼而产生的铜矿废弃地，不仅占用了土地资源，而且对相邻的生态系统和人类健康产生严重的影响[1-4]，而铜矿废弃地因其营养状况差和重金属的毒害导致植被自然恢复困难[5-6]。为了矿区废弃地土壤资源的利用和生态环境的保护，人们开展了大量的矿区废弃地植被恢复和修复等研究工作[4,7]。植物修复因其成本低、环境友好以及可大规模原位修复等优点备受关注[8-9]。研究发现一些能源植物对重金属具有一定的耐受性[5-6]，利用能源植物对重金属污染矿区废弃地进行生态重建，能将土壤修复与生物能源生产有机结合，具有广阔的应用前景[10]。其中苏丹草作为一年生禾本科高粱属能源植物，适应性广、植株根系发达、生物量大、生长周期短、可多次刈割，有望用于矿区废弃地的生态重建。然而由于矿区废弃地土壤的水肥条件恶劣、重金属等有害物质含量高，能源植物很难定居或生长不良[4]，从而限制了能源植物苏丹草对铜矿废弃地的植物修复效率。

植物内生细菌(endophytic bacteria)是指能在健康植物组织内栖居而对植物不造成实质性危害并与植物建立了和谐联合关系的微生物[11]。植物内生细菌可以通过产生的ACC脱氨酶、IAA、铁载体以及精氨酸脱羧酶等促进植物生长，提高植物对重金属的耐受性和富集能力[8,12-16]。虽然有关重金属污染土壤和植物体内重金属抗性细菌的筛选、菌株对植物生长和富集重金属的影响等研究已有不少报道[14,17-19]，但有关从耐受重金属的苏丹草根内分离Cu抗性植物促生细菌并研究其生物学特性及其对苏丹草生长和富集Cu的影响的研究至今未见报道。本项目的开展有望为植物-微生物联合修复体系的建立和铜矿废弃地生态修复以及能源植物的生产提供理论基础和技术途径。

1 材料与方法

1.1 土壤采集和分析

供试土壤采自南京汤山铜矿废弃地(31°14′～32°07′N，118°22′～119°14′E)0～20 cm表层土，土壤类型为黄棕壤，自然风干过20目筛，土壤pH、有机质、速效性氮、磷和钾等测定按土壤农化常规分析法[20]。土壤Cu、Pb、Zn、Mn总量测定采用硝酸-盐酸-高氯酸消煮土壤样品，5% HNO3定容后用电感耦合等离子发射光谱仪(ICP-OES)测定；土壤水溶态、醋酸铵提取态和二乙基三胺五乙酸(DTPA)提取态Cu含量的测定：准确称取自然风干土壤3.00 g于50 ml离心管中，以1︰2的土水比分别加入6 ml去离子水、1 mol/L NH4OAC和0.05 mol/L DTPA，分别振荡提取2 h，12 000 r/min离心10 min后，取上清液用ICP-OES分别测定溶液中的土壤水溶态、NH4OAC提取态和DTPA提取态Cu含量。

1.2 供试植物

供试植物为禾本科能源植物苏丹草(Sorghum sudanense(Piper)Stapf.)，种子购自于江苏省南京市明达种子经营部。

1.3 苏丹草根内生细菌的分离筛选和苏丹草生物量及铜含量分析

盆栽试验在温室中进行，所用土壤为上述铜矿废弃地土壤，每公斤土壤拌入灭菌有机肥(含有机质310 g/kg，氮20 g/kg，磷8.7 g/kg，钾7.1 g/kg)2 g，土壤充分混匀后装入塑料盆，每盆6.0 kg土壤，每盆播入经2% 次氯酸钠表面消毒的苏丹草种子15颗，播种两周后间苗，每盆留苗8株，培养温度：白天25～32℃，夜间21～25℃，相对湿度75%～79%，苏丹草生长期间适时浇水，苏丹草生长80 天后用于细菌的分离筛选。

取出苏丹草植株，用灭菌剪刀取植株根部和地上部，先用自来水将根部清洗干净，然后用无菌水再清洗一遍，接着用75% 乙醇浸泡3 min后，用无菌水冲洗一遍，2.5% 次氯酸钠再浸泡2 min，无菌去离子水冲洗3次。将表面消毒的根置于无菌研钵内研磨后取匀浆液涂布在含有10 mg/L Cu2+的1/5 LB平板上，同时取最后一次浸洗的无菌水100 μl涂布于1/5 LB平板上，以检测样品表面消毒是否彻底。从平板上随机挑取细菌单菌落，纯化后保存待用。

用去离子水充分漂洗植株根部和地上部后置于105℃ 烘箱杀青30 min，55℃ 条件下烘干至恒重，称取植物组织干重；烘干的植物组织用研磨机粉碎，并准确称取200 mg样品于微波消煮管中，加入2 ml的HNO3消煮至澄清透明，消煮后的样品加5% HNO3冷却后定容至10 ml，用ICP-OES测定溶液中的Cu浓度。

1.4 细菌生物学特性研究

1.4.1 菌株产ACC脱氨酶能力测定 参考Belimov等[12]方法，将供试菌株接入SMN培养基在28℃ 的摇床中培养18 h，离心收集菌体，用SM培养基将菌体洗涤2次后分别等量接入SM(无氮培养基)、SMC(ACC为唯一氮源)、SMN((NH4)2SO4为唯一氮源)液体培养基。28℃ 摇床振荡培养48 h，比色法测定不同培养基中菌悬液的OD600值。在SMC和SMN培养基中生长良好，而在SM培养基中不能生长的菌株具有ACC脱氨酶活性。

1.4.2 菌株产铁载体能力测定 将供试菌株接入1/5 LB液体培养基，在30℃ 摇床中振荡培养48 h，发酵液6 000 r/min离心10 min，取1.0 ml上清液加入1.0 ml CAS检测液，混匀，以去离子水作对照，1 h后测定630 nm波长处的吸光值；取1.0 ml未接菌的1/5 LB液体培养基与1.0 ml CAS检测液混匀，同法测定为参比值[21-22]。

1.4.3 菌株产吲哚乙酸(IAA)能力测定 将色氨酸配成2.5 mg/ml的溶液，过滤除菌。准备LB液体培养基试管(2 ml)，灭菌后加入过滤除菌的色氨酸溶液0.5 ml，使培养基中色氨酸的最终浓度为0.5 mg/ml。将供试菌株接入上述培养液中，在30℃ 摇床中振荡培养72 h，发酵液6 000 r/min离心10 min，取1.0 ml上清液，加50 μl 10 mmol/L 的正磷酸和2 ml Sackowski’s显色剂，混匀，黑暗下25℃ 显色，30 min后测定530 nm波长处吸光值。以双蒸水代替培养液作为对照。以浓度为5、10、20、40、60 mg/L的IAA标准液作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度[23-24]。

1.4.4 菌株产精氨酸脱羧酶(ADC)能力测定 参考Sun等[14]的方法，培养基配方为：蛋白胨5.0 g，牛肉膏5.0 g，D-葡萄糖0.5 g，维生素B6(吡哆醛)5 mg，溴甲酚紫(1.6%)0.625 ml，酚红0.02 g，蒸馏水1 L，琼脂18 g，pH 6.0。以上培养基分为两份，一份不加L-精氨酸盐酸盐作为空白对照，一份加入L-精氨酸盐酸盐，使最终浓度为1%，再调pH 6.0～6.3，分别分装试管中，121℃ 灭菌10 min。将供试菌株分别接入上述两种培养基中，30℃培养3～5 天，若对照管不变色，而测试管变为紫红色则为阳性，菌株产精氨酸脱羧酶(arginine decarboxylase)，不变色则为阴性。

1.4.5 菌株溶解难溶性磷酸盐能力测定 采用溶磷圈法对细菌的溶磷特性进行测定。用牙签将供试菌株分别点接种于NBRIP培养基上[25]，置于30℃ 培养箱中培养4 天，观察有无透明溶磷圈产生。

1.5 菌株对环境条件的抗性

1.5.1 Cu和抗生素抗性 供试菌株划线接种于含CuSO4的1/5 LB培养基，使Cu2+的终浓度为20，50，100，200，500 mg/L，30℃ 培养3 天，观察其能否生长。

将供试菌株点接于含不同浓度抗生素的固体培养基，使抗生素终浓度如下：氨苄青霉素50，100，200 mg/L；卡那霉素20，50，100 mg/L；链霉素20，50，100 mg/L；氯霉素50，100，200 mg/L，28℃ 培养48 h，观察其能否生长。

1.5.2 温度、初始pH和盐浓度对菌体生长的影响将供试菌株点接于1/5 LB固体平板，分别在7℃、15℃、28℃、37℃、42℃ 的温度下培养72 h，观察其能否生长及生长情况。

用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH将1/5 LB培养基的pH调节至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。将活化的供试菌株分别点接于上述不同pH的培养基中，28℃ 培养72 h，观察其能否生长及生长情况。

按质量百分比浓度分别配制NaCl浓度为0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，5.0% 的1/5 LB培养基。将供试菌株分别点接于上述培养基上，28℃ 培养72 h，观察其能否生长。

1.6 菌株的分子鉴定

参考萨姆布鲁克[26]的《分子克隆实验指南》提取细菌基因组DNA。用16S rRNA基因通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，以分离菌株的总DNA为模板进行PCR扩增。扩增体系(25 μl)为：10×Taq DNA polymerase buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，引物27F和1492R(10 mmol/L)各0.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，5 U/μl Taq酶0.15 μl，适量DNA模板，将ddH2O补足至25 μl。PCR反应条件为：94℃ 预变性5 min；94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，循环30次；72℃后延伸10 min。PCR产物用0.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。将所获得序列用BLAST软件与GenBank中已知的16S rRNA基因序列进行比对分析，鉴定菌株。

1.7 菌株对苏丹草幼苗生长和Cu含量的影响

选择大小均匀的苏丹草种子经75% 无水乙醇溶液消毒5 min，用无菌去离子水漂洗种子，置于25℃恒温箱中催芽18 h。将菌株接种于LB液体培养基中，30℃ 摇床180 r/min振荡培养18 h，8 000 r/min离心5 min收集菌体，用无菌生理盐水清洗2次，最终制备成108cfu/ml菌悬液。待种子萌芽后，选取萌芽一致的种子用细菌悬液浸泡4 h，并以无菌生理盐水浸泡处理作为对照。将苏丹草种子播种于含灭菌水琼脂(0.6%)的平皿中进行培养，每皿种植10株苏丹草。Cu处理浓度为0和4.0 mg/L，设3个重复。平皿置于光照培养架上培养，每天光照12 h，培养温度为15～25℃，每天定量浇Hoagland营养液，培养15 天后分析。苏丹草生物量和Cu吸收量的测定同1.3节。

1.8 数据处理

所有试验数据均采用Microsoft Office Excel 2007处理，Originpro 8.0作图，采用SPSS 20.0对数据进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 铜矿废弃地土壤理化分析

铜矿废弃地土壤理化特性：pH 6.29，有机质8.0 g/kg，速效氮58.6 mg/kg，速效磷8.5 mg/kg，速效钾50.2 mg/kg，总铜2 297 mg/kg，水溶性铜4.06 mg/kg，醋酸铵提取态铜 32.2 mg/kg，DTPA提取态铜171 mg/kg，总铅13.4 mg/kg，总锌91.5 mg/kg，总锰652 mg/kg。该铜矿废弃地土壤营养比较贫乏，土壤主要重金属污染元素为Cu，土壤Cu含量明显高于国家土壤环境质量三级标准(Cu质量标准≤400 mg/kg)。由此可见，Cu的毒性和营养贫乏是矿区废弃地中限制植物生长的重要因素[4]。

2.2 菌株的筛选和鉴定

虽然铜矿废弃地中高含量的Cu对植物的生长会产生重要的影响，供试能源植物苏丹草在供试铜矿废弃地上能够正常生长，每盆苏丹草根和地上部干重分别达4.2 g和10.5 g。另外，苏丹草根和地上部Cu含量分别达673 mg/kg和40 mg/kg。苏丹草根表面消毒后用无菌去离子水冲洗3次并将最后一次冲洗的无菌水涂布于1/5 LB平板上，培养3 天后在平板上没有菌落出现，证明苏丹草根表面消毒彻底，从苏丹草根中分离到的细菌可以认为是根内生细菌[14]。虽然重金属的毒害对微生物的生长产生重要的影响，但是微生物可以通过多种机制提高其对重金属的耐受能力[8]，本试验从苏丹草根中分离到15株Cu抗性植物内生细菌，说明这些菌株已经适应了苏丹草根部环境，经过对分离菌株ACC脱氨酶活性的测定，菌株K1-6和K3-9具有ACC脱氨酶活性，因此，选择K1-6 和K3-9菌株作为进一步研究的功能菌株。根据16S rRNA基因序列分析，菌株K1-6和K3-9分别被鉴定为根瘤菌属(Rhizobium sp.K1-6)和肠杆菌属(Enterobacteraerogenes K3-9)，Genbank登录号分别为KJ631290 和KJ631293，同源性分别为100% 和99%。

2.3 菌株的生物学特性

2.3.1 菌株对Cu和抗生素的抗性 菌株K1-6和K3-9 分别能在Cu含量500 mg/L和100 mg/L的条件下正常生长，其中菌株K1-6比菌株K3-9具有更强的Cu抗性。由表1可知，菌株K1-6和K3-9对抗生素的抗性存在一定的差异。菌株K1-6对4种抗生素均具有一定的抗性，而菌株K3-9对链霉素敏感，对氨苄青霉素和氯霉素有较强的抗性。菌株K1-6和K3-9抗生素抗性的差异可能与菌株本身携带的抗性质粒有关。

表1　菌株对抗生素的抗性Table 1 Antibiotics-resistances of bacterial strains

2.3.2 菌株的植物促生特性 由表2可以看出，分离自苏丹草根部的Cu抗性和ACC脱氨酶活性菌株具有不同的植物促生特性。菌株K1-6和K3-9均具有产生IAA的能力，产量为21.8～54.9 mg/L。菌株K1-6不产铁载体和精氨酸脱羧酶，而菌株K3-9能够产生铁载体和精氨酸脱羧酶，菌株K1-6和K3-9均能够溶解难溶性磷酸盐，在NBRIP培养基上有透明的溶磷圈产生。从Cu耐性植物海州香薷和鸭趾草植株体内分离到的一些细菌菌株也具有产生ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶的能力[14]。

表2　菌株的植物促生特性Table 2 Plant growth-promoting characteristics of bacterial strains

2.3.3 温度、pH和盐浓度对菌株生长的影响 由表3可以看出，菌株K1-6和K3-9为中温菌，在15～37℃下能较好生长，最适生长温度为30℃左右；菌株K1-6和K3-9生长的pH范围是5～10，菌株K1-6耐酸，在pH 4的条件下能生长；菌株K1-6和K3-9均可在0.5%～3% 的NaCl中良好生长，菌株K1-6也能够在5% NaCl中生长。由此可见，与菌株K3-9相比，菌株K1-6有较强的耐酸和耐受高渗的能力。

表3　培养温度、初始pH和盐浓度对菌株生长的影响Table 3 Effects of culture temperature,initial pH and NaCl concentration on strain growths

2.4 菌株K1-6和K3-9对苏丹草生长的影响

研究表明，能够产生ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶的植物内生细菌能够显著促进植物的生长和对重金属的耐受性[14-15,27-28]。菌株K1-6 和K3-9能够产生ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶，能够显著促进苏丹草的生长(图1)。另外，由图1可以看出，菌株K1-6和K3-9对苏丹草生长的影响存在明显差异，在不添加Cu2+的条件下，接菌株K1-6处理的苏丹草根和地上部干重分别比对照增加46% 和40%，差异达显著水平(P＜0.05)，而接菌株K3-9处理的苏丹草根和地上部干重分别比对照增加11% 和18%，但差异未达显著水平(P＞0.05)；在添加Cu2+的条件下，接菌株K1-6处理的苏丹草根和地上部干重分别比对照增加27% 和13%，差异达显著水平(P＜0.05)，接菌株K3-9处理的苏丹草根和地上部干重分别比对照增加41% 和37%，差异达显著水平(P＜0.05)。由此可见，在Cu2+胁迫条件下，菌株K3-9比菌株K1-6能够更好地促进苏丹草的生长。

图1　菌株K1-6和K3-9对苏丹草生长的影响Fig.1 Effects of strains K1-6 and K3-9 on growths of Sorghum sudanense

图2　菌株K1-6和K3-9对苏丹草组织Cu含量的影响Fig.2 Effects of strains K1-6 and K3-9 on Cu contents of Sorghum sudanense

图3　菌株K1-6和K3-9对苏丹草吸收Cu的影响Fig.3 Effects of strains K1-6 and K3-9 on total Cu uptakes of Sorghum sudanense

2.5 菌株K1-6和K3-9对苏丹草富集铜的影响

菌株K1-6和K3-9对苏丹草根和地上部Cu含量的影响见图2。由图2可以看出，接菌株K1-6处理的苏丹草根和地上部Cu含量分别比对照增加46% 和85%，差异达显著水平(P＜0.05)，而接菌株K3-9处理的苏丹草根和地上部Cu含量与对照相比没有显著差异(P＞0.05)。另外，与对照相比，接菌株K1-6处理的苏丹草根和地上部吸收的总Cu分别比对照增加88% 和114%，差异达显著水平(P＜0.05)，接菌株K3-9处理的苏丹草根和地上部吸收的总Cu分别比对照增加44% 和16%。值得注意的是，苏丹草富集的Cu主要分布在根部组织，接菌处理根中Cu含量是地上部Cu含量的17～25倍，而根中吸收的总Cu含量是地上部吸收的总Cu含量的16～23倍。研究表明，能够产生ACC脱氨酶、IAA、铁载体和精氨酸脱羧酶的植物内生细菌不仅能够显著促进植物的生长而且能够显著促进植物对重金属的富集能力[14-15,27]。刘莉华等[29]在龙葵的根际土壤分别接入Cd抗性植物内生细菌，结果表明，接菌处理龙葵地上部和根部Cd的吸收量比对照增加50%；Zhang 等[8]发现，重金属抗性和ACC脱氨酶产生细菌能够显著增加油菜对Pb的吸收。本试验也表明，Cu抗性植物促生内生细菌K1-6和K3-9菌株能够显著促进苏丹草根和地上部对Cu的富集能力。虽然菌株K3-9没有显著影响苏丹草根和地上部Cu含量，但菌株K3-9显著促进了苏丹草根的生长，从而增加了苏丹草根对Cu的总吸收量(图3)。Dell’Amico等[30]也发现Cd抗性根际细菌没有影响油菜根和茎中Cd的含量，但提高了油菜生物量，从而显著提高了油菜对Cd的总吸收量。另外，在培养15 天后在添加Cu2+(100 mg/L)和链霉素(100 mg/L，检测菌株K1-6)或氯霉素(100 mg/L，检测菌株K3-9)的1/5 LB平板上可以在苏丹草根中检测到菌株K1-6和K3-9，其细胞数量达104CFU/g根，而对照处理的根中未检测到细菌菌落，说明菌株K1-6和K3-9可以在苏丹草根中成功定殖。虽然菌株K1-6和K3-9在平皿培养条件下表现出了对苏丹草生长和耐受Cu的促进作用，但有关菌株K1-6和K3-9对生长在铜矿废弃地中的苏丹草的生长、耐受和富集Cu的效应及其机制等值得进一步研究。

3 结论

1)供试苏丹草能够在铜矿废弃地土壤中生长，并能够在苏丹草根中分离筛选到Cu抗性植物促生内生细菌K1-6和K3-9菌株，16S rDNA序列分析表明，菌株K1-6和K3-9分别属于根瘤菌属(Rhizobium sp.K1-6)和肠杆菌属(Enterobacter aerogenes K3-9)。

2)菌株K1-6和K3-9具有多种植物促生特性，菌株K1-6和K3-9产生植物促生物质的能力不同。另外，菌株K1-6和K3-9对温度、pH和盐浓度具有一定的耐受性。

3)研究表明，K1-6和K3-9菌株能够显著促进苏丹草的生长，提高苏丹草对Cu的耐受性，并强化苏丹草根部对Cu的富集能力。另外，菌株K1-6和K3-9对苏丹草的生长、富集和耐受Cu的影响不同。

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Isolation of Endophytic Bacteria from Roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense and Their Biological Characteristics

WANG Lu,HE Linyan,SHENG Xiafang*
(Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology,Ministry of Agriculture,College of Life Science,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:Two ACC deaminase-producing endophytic bacteria(K1-6 and K3-9)were obtained from the roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense grown in Cu mine wasteland.The biological characteristics of the two endophytic bacterial strains were characterized.Strains K1-6 and K3-9 showed resistance to high levels of Cu and antibiotics,solubilized inorganic phosphate,and produced indole acetic acid(IAA).Strain K3-9 could also produce siderophores and arginine decarboxylase.Strains K1-6 and K3-9 had also the characteristics of acid or alkali and salt tolerance and temperature resistance.Strains K1-6 and K3-9 were identified as Rhizobium sp.K1-6 and Enterobacter aerogenes K3-9 based on the analyses of their 16S rDNA gene sequences,respectively.Plate culture experiment was used to investigate the effects of the two endophytic bacterial strains on the growth and Cu accumulation of Sorghum sudanense grown in 0 and 4 mg/L of Cu added as CuSO4.The results showed that significant(P＜0.05)increase was observed in the root(ranging from 10.6% to 45.5%)and above-ground tissue(ranging from 13% to 40%)dry weight of the bacteria-inoculated Sorghum sudanense compared with the control.Inoculation with strain K1-6 was found to significantly increase Cu contents of the roots and above-ground tissues of Sorghum sudanense compared with the control,however,no significant difference was observed in Cu contents of the roots and above-ground tissues between the strain K3-9-inoculated and control plants.Furthermore,total Cu uptakes of the roots and above-ground tissues of the plants inoculated with strain K1-6 were increased by 88% and 114%(P＜0.05)respectively compared with the control,while total Cu uptakes of the roots was increased by 44% in the presence of strain K3-9 compared with the control.Notably,Cu content of the roots was 16-23-fold higher than that of the above-ground tissues of the plants inoculated with the two strains.The above results showed that the endophytic bacterial strains K1-6 and K3-9 from the roots of Cu-tolerant Sorghum sudanense have the innate multiple plant growth-promoting traits,can increase the growth and Cu tolerance of Sorghum sudanense,and enhance Cu accumulation in the roots.In addition,the increases in the growth,Cu accumulation and tolerance of Sorghum sudanense are dependent on the strains.

Key words:Cu mine wasteland; Sorghum sudanens; Plant growth-promoting endophytic bacteria; Rhizobium sp.K1-6; Enterobacter aerogenes K3-9

作者简介：王璐(1988—)，女，安徽宣城人，硕士研究生，主要从事重金属污染土壤植物-微生物联合修复研究。E-mail:wanglu813126@ 126.com

* 通讯作者(xfsheng@njau.edu.cn)

基金项目：①国家自然科学基金项目(40871127，41171257)资助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.015

中图分类号：X53