黄鼬干粉胶囊对再生障碍性贫血模型小鼠造血功能的影响*

2016-04-23姚金华杜志荣夏小军范晓娜王生梅庆阳市中医医院甘肃庆阳750002甘肃中医药大学国家中医药管理局中药药理学科研三级实验室庆阳市西峰区疾病预防控制中心甘肃省肿瘤医院

西部中医药 2016年2期

姚金华，马　骏，杜志荣，夏小军，段　赟，田　莹，范晓娜，王生梅庆阳市中医医院，甘肃庆阳75000；2甘肃中医药大学国家中医药管理局中药药理学科研三级实验室；庆阳市西峰区疾病预防控制中心；甘肃省肿瘤医院

姚金华1，马骏2△，杜志荣3，夏小军4，段赟4，田莹1，范晓娜1，王生梅1
1庆阳市中医医院，甘肃庆阳745000；2甘肃中医药大学国家中医药管理局中药药理学科研三级实验室；3庆阳市西峰区疾病预防控制中心；4甘肃省肿瘤医院

［摘要］目的：观察黄鼬干粉胶囊对再生障碍性贫血（AA）模型小鼠造血功能的影响及作用机制。方法：采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，观察黄鼬干粉胶囊对小鼠外周血象、骨髓有核细胞数（BMNC）、骨髓粒细胞-巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、血清中可溶性细胞间黏附因子1（sICAM-1）和骨髓组织病理学的影响。结果：黄鼬干粉胶囊能明显增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量，能增加骨髓BMNC数量，还能升高骨髓CFU-GM和降低血清sICAM-1。与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨髓组织病理学结果表明，黄鼬干粉能明显改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶减少，促进骨髓造血。结论：黄鼬干粉胶囊能改善AA模型小鼠造血功能，其作用机制可能与调节骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有关。

［关键词］黄鼬干粉胶囊；再生障碍性贫血；外周血象；骨髓有核细胞数；骨髓粒细胞-巨噬细胞集落生成单位；血清中可溶性细胞间黏附因子1；组织病理

Influence of Yellow Weasel Dry Powder Capsules on Hemopoiesis of Mice Model with Aplastic Anemia

YAO Jinhua1,MA Jun2△,DU Zhirong3,XIA Xiaojun4,DUAN Yun4,TIAN Ying1,FAN Xiaona1,WANG Shengmei1
1 Qingyang Municipality TCM Hospital,Qingyang 745000,China;2 Three-step Lab for Pharmacology of Chinese Materia Medica of State Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China of Gansu University of Traditional Chinese Medicine;3 Xifeng District Center for Disease Control and Prevention of Qingyang Municipality 4 Gansu Provincial Cancer Hospital

Abstract Objective:To observe the influence of yellow weasel dry powder capsules on hemopoiesis of mice model with aplastic anemia (AA) and the mechanism.Methods:Mice model with AA was prepared by X-ray,cy-clophosphamide and chloramghenicol,the influence of yellow weasel dry powder capsules on peripheral blood,bone marrow mononuclear cells (BMNC),colony forming unit-granulocyte and macrophage (CFU-GM),soluble intercellular adhesion molecules-1 (sICAM-1) and the histopathology of bone marrow were observed.Results:Yellow weasel dry powder capsules could increase the numbers of HGB,RBC,WBC and PLT in peripheral blood of the mice obviously,increase the amount of BMNC,raise CFU-GM and decrease sICAM-1.Compared with model control group,the difference showed statistical meaning (P＜0.05).Histopathological results of bone marrow demonstrated that yellow weasel dry powder could notably improve hypofunction of bone marrow hyperplasia and the decrease of hemopoietic focus of AA mice,and promote hemopoiesis of bone marrow.Conclusion:Yellow weasel dry powder capsules could effectively improve hemopoiesis of AA mice model,and its mechanism might be related to regulating the balance of CFU-GM and sICAM-1.

Keywords yellow weasel dry powder capsules;AA;peripheral blood;BMNC;CFU-GM;sICAM-1;histopathology

黄鼬(学名Mustela sibirica)，俗名黄鼠狼，为鼬科小型杂食动物［1］。黄鼬肉骨在我国民间历来被视为一种药材，认为具有抗癌、增强免疫力等功效，对急性白血病(AL)、再生障碍性贫血(AA)、免疫性血小板减少症等疾病也有一定疗效。甘肃陇东地区民间常以黄鼬干粉用于AA及AL化疗后骨髓抑制患者，也用以治疗骨髓增生低下性疾病，效果满意。本实验拟观察黄鼬干粉胶囊对AA模型小鼠骨髓造血功能的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物昆明小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量18～22 g，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供，实验生产许可证号：SCXK(甘) 2010-0001，动物实验合格证号：0000981。

1.2药物和试剂黄鼬干粉胶囊(甘肃省庆阳市中医医院提供，批号：130706)，临用前将药粉用8倍量蒸馏水浸泡2小时，水浴锅煎煮30分钟，800rpm离心5分钟，取上清液，80℃浓缩至30％和90％的浓度，4℃冰箱保存备用；司坦唑醇片(广西南宁百会药业集团有限公司生产，批号：130416)；注射用环磷酰胺(CTX)(山西普德药业股份有限公司生产，批号：04120103)；氯霉素注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司生产，批号：130523)；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657)；注射用硫酸链霉素(华北制药股份有限公司生产，批号：20130615)；M199培养基(上海源叶生物科技有限公司生产，批号：130811)；马血清(郑州益康生物有限公司生产，批号：130608)；琼脂粉(青岛高科园海博生物技术有限公司生产，批号：20130406)；ELISA(sICAM-1)试剂盒(产品型号E12789，规格96T，上海华壹生物有限公司生产，批号：20130522)。

1.3实验仪器医用直线加速器(型号BD-6M，北京医疗器械研究所提供)；低温高速离心机［Biofuge fresco(美国)］；血细胞分析仪［CD1200(美国)提供］；奥林帕斯生物显微镜［Olympus公司(日本)生产］；BS110S型sartorius电子天平(北京赛多利斯天平有限公司提供)。

1.4实验方法

1.4.1对AA模型小鼠外周血象、骨髓有核细胞数（BMNC）和骨髓组织病理学的影响［2-4］

1.4.1.1分组、造模、给药取小鼠50只，随机分为5组，每组10只。除正常对照组外，其余各组采用医用直线加速器X射线一次性全身照射(皮源距100 cm，辐射剂量为8.0 Gy/min，辐射时间为4分钟)，分别于第4天、5天、6天腹腔注射环磷酰胺50.0 mg/kg及氯霉素62.5 mg/kg，连续3天。造模的同时，正常对照组和模型对照组灌胃生理盐水，阳性对照药组灌胃司坦唑醇片1 mg/kg(相当于人体临床日用量的10倍)，黄鼬干粉胶囊高、低剂量组分别灌胃黄鼬干粉胶囊煎液18 g/kg 和6 g/kg(相当于临床人1日用量的30倍和10 倍)。均为0.02 mL/g，各组每天1次，连续15天。

1.4.1.2外周血象及BMNC计数末次给药后次日，摘眼球取血，用血细胞分析仪测定外周血象变化。随后各组小鼠脱颈椎处死，分离出两侧股骨。取右侧股骨中段7 mm，用3％冰醋酸溶液10 mL冲出全部骨髓，并经6号针头抽吸一次，分散骨髓细胞。然后通过血细胞计数板在显微镜下计数骨髓有核细胞数(BMNC)。

1.4.1.3骨髓切片制备与观察将左侧股骨浸入4％中性甲醛内固定2小时，再用2％的硝酸脱钙2小时，水洗2次，室温下乙醇梯度脱水各2次，然后用甲液、乙液顺序浸透各12小时，用包埋液封闭，放入-20℃冰箱内过夜，第2天进行切片，苏木素-姬姆萨-伊红染色，最后置于光学显微镜下观察骨髓增生程度及造血细胞变化。

1.4.2对AA模型小鼠粒-巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、可溶性黏附因子1(sICAM-1)的影响［5-8］

1.4.2.1小鼠骨髓CFU-GM的检测小鼠分组、模型制备及给药同上。培养体系为含20％马血清的M199培养液3.5 mL，5块0.3 mm3小鼠肺组织生成的细胞刺激因子，适量青、链霉(浓度100 U/mL、100 μg/mL)，分别加入以上各组各时间点小鼠的骨髓单个核细胞(终浓度为2×105)，置于37℃水浴15分钟，加入琼脂0.3 mL(终浓度为0.3％)，再放入2.7％的甲基纤维素(终浓度为0.9％)，振荡混匀后浇入培养皿，移入含5％ CO2培养箱，37℃培养7天，用倒置显微镜计数各组生成的细胞集落，≥50个细胞组成的细胞团为1个细胞集落。

1.4.2.2小鼠血清sICAM-1的检测末次给药后，小鼠眼眶静脉窦取血0.5 mL，室温放置20分钟，以3 000 r/min离心20分钟，取血清5 μ L，按试剂盒说明书操作，检测血清中sICAM-1浓度值。

1.5统计学方法所有数据均经SPSS 15.0统计学软件进行处理，计量资料用(±s)表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组小鼠外周血象和BMNC比较模型对照组小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量明显减少，BMNC数明显降低，与正常对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。司坦唑醇片组和黄鼬干粉胶囊高、低剂量组小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量以及BMNC数量明显增加，与模型对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

正常对照组骨髓增生活跃，全片有核细胞密布，巨核细胞多见。模型对照组骨髓增生极度低下，造血细胞明显减少，大量脂肪细胞代替造血细胞，间质水肿，巨核细胞未见。黄鼬干粉胶囊高、低剂量组及司坦唑醇片组仍显示骨髓增生低下，但可见散在造血灶，偶见巨核细胞。见图1。

表1　各组小鼠外周血象和BMNC比较

图1　各组小鼠骨髓组织病理学表现（40×）

2.2各组小鼠骨髓CFU-GM、血清SICAM-1比较采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，模型对照组小鼠骨髓CFU-GM生成量明显降低，血清中SICAM-1明显升高，与正常对照组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。司坦唑醇片组和黄鼬干粉胶囊高、低剂量组均能提高模型小鼠骨髓CFU-GM生成量，降低小鼠血清中SICAM-1含量，与模型对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2　各组CFU-GM、SICAM-1比较(骨髓细胞数4×105)

3　讨论

AA是一组由化学、物理、生物及自身免疫等因素所致的骨髓造血干细胞和(或)造血微环境损伤而出现的造血功能衰竭性疾病。其主要的病理改变是红骨髓向心性萎缩，被脂肪髓代替，无恶性细胞及网状纤维增生，以致外周血液中全血细胞减少出现贫血、出血、感染等临床症状［9-10］。

AA属于中医“髓劳病”范畴［11］。《本草纲目》记载，黄鼬的肉甘、温，有小毒，入肺、肾二经，具有杀虫疗疮、温肾缩尿的功效，治疥疮、疮溃不愈合、尿频等症。甘肃陇东地区民间AA及AL化疗后骨髓抑制的患者大多服用黄鼬干粉［12-13］，但相关实验研究尚未见报道。

本实验研究表明，采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，黄鼬干粉胶囊能明显增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量，能增加骨髓BMNC和CFU-GM数量，降低血清SICAM-1水平。骨髓组织病理学结果表明，黄鼬干粉胶囊能明显改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶减少，促进骨髓造血。其治疗AA的作用机制可能与调节骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有关。本研究为中医临床使用黄鼬干粉胶囊治疗AA和进一步新药研发提供了药理学实验依据。

参考文献

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