喉肿瘤相关成纤维细胞促进原代喉鳞状细胞癌细胞体外生长

王　媚　吴春萍　曹晓娟　郑文伟　范国康

(1浙江大学医学院附属第二医院耳鼻咽喉科　杭州　310009;2上海中医药大学附属市中医医院耳鼻咽喉科　上海　200071;

3复旦大学附属眼耳鼻喉科医院头颈外科　上海　200031;4嘉兴学院附属第二医院耳鼻咽喉科　嘉兴　314000)



喉肿瘤相关成纤维细胞促进原代喉鳞状细胞癌细胞体外生长

王媚1,2▲吴春萍3▲曹晓娟4郑文伟4范国康1△

(1浙江大学医学院附属第二医院耳鼻咽喉科杭州310009;2上海中医药大学附属市中医医院耳鼻咽喉科上海200071;

3复旦大学附属眼耳鼻喉科医院头颈外科上海200031;4嘉兴学院附属第二医院耳鼻咽喉科嘉兴314000)

【摘要】目的验证喉肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)对原代培养的喉鳞状细胞癌 (laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC)细胞的体外生长是否有促进作用。方法选取20例喉癌临床标本进行原代培养,将生长出的原代喉癌细胞中的CAFs通过差速消化法去除后继续单独培养,相差显微镜观察喉癌细胞在传代培养过程中的形态学变化,流式细胞仪检测喉癌细胞在传代过程中凋亡细胞比例的变化,Western blot检测喉癌细胞在传代过程中凋亡蛋白Caspase 3表达水平的变化,以始终与CAFs共培养传代的喉癌细胞作为对照。结果与CAFs分离后喉癌原代细胞在体外传代培养过程中生长活性很快下降,多数在3代以内停止生长。相差显微镜观察到形态学上凋亡漂浮的喉癌细胞逐代增多,流式细胞仪检测到的凋亡细胞比例逐代增加,Western blot检测到的Caspase 3表达水平逐代增加;而始终与CAFs共培养生长的LSCC细胞在传代过程中生长活性却无明显下降 (P<0.05)。结论喉肿瘤相关成纤维细胞对体外原代培养的LSCC细胞的生长具有明显的促进作用。

【关键词】肿瘤相关成纤维细胞;喉鳞状细胞癌;原代培养;凋亡

肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中非常重要的基质细胞成份,通过分泌多种生长因子、炎性因子、调控抗肿瘤免疫以及与肿瘤细胞之间的相互作用来调控肿瘤的生长及侵袭转移[1-4]。文献表明,多种实体瘤的CAFs均能够促进相应肿瘤细胞的体外增殖及侵袭等能力[5-7],但目前相关研究均是用实体肿瘤已建成的细胞系通过体外培养来进行的,而CAFs对于相应原代肿瘤细胞是否具有类似的调控作用国内外尚未见报道。

我们的前期研究已经在原代喉癌标本组织[8]及喉癌裸鼠移植瘤标本[9]中成功分离出了CAFs,发现其对于喉癌细胞系HEp-2细胞具有明确的促进生长、侵袭及成瘤作用,本研究拟在此基础之上进一步研究喉癌标本组织中的CAFs对喉癌原代培养的肿瘤细胞是否具有体外促进生长的功能。此外,我们在之前的原代培养建系[10]过程中已经发现原代喉癌组织中的CAFs似乎能够明显抑制喉癌原代肿瘤细胞体外培养时的凋亡进程。为了证实这一假设,设计了本文的研究实验,将原代培养的喉癌组织中的喉癌细胞和CAFs共培养及分离培养,从形态学到分子生物学水平检测共培养及分离培养两种条件下喉癌细胞凋亡程度的变化。我们发现,没有CAFs的共培养,喉癌细胞很快发生凋亡,反之,喉癌细胞几乎不发生凋亡,表明CAFs对原代培养的喉癌细胞适应新环境的生长可以起到决定性的抗凋亡作用。这样的结果与目前文献报道的CAFs对实体肿瘤细胞系的生长和侵袭仅具有部分促进作用不同。

临床肿瘤细胞的远处转移过程中也存在着相似的现象。单个肿瘤细胞脱离原先生长的肿瘤微环境进入血液循环,然后进入非肿瘤组织的“转移灶”生长,新的“转移灶”没有之前适合的生长条件,转移而来的肿瘤细胞的生长与体外原代培养类似,在生长增殖初期非常容易凋亡。而“转移灶”可以有先于肿瘤细胞存在的CAFs,它们与原发肿瘤部位的CAFs有不同的起源[11-12],可能会对转移而来的肿瘤细胞的凋亡起到强有力的抑制作用,进而促进“转移灶”的成功生长。因此,如果能够在转移早期针对CAFs进行靶向治疗,将有希望抑制转移而来的肿瘤细胞的早期增殖,将“转移灶”消灭在萌芽状态。本文的研究结果将为此种靶向治疗提供初步的实验依据。

材 料 和 方 法

喉癌标本的原代培养采集20例确诊为喉鳞状细胞癌(laryngeal squameus cell carcinoma,LSCC)的患者标本,所有标本的采集均得到复旦大学附属眼耳鼻喉科医院伦理委员会的批准,患者均签署知情同意书。患者中声门上型16例,声门型4例,均为男性,年龄45～63岁。将所采集喉癌标本组织用生理盐水充分漂洗后依次在含有聚维酮碘 (1∶10稀释)、硫酸庆大霉素 (1∶8稀释)及盐酸林可霉素 (1∶8稀释)的生理盐水中浸泡5 min,再将肿瘤组织充分剪碎至体积约1～2 mm3大小,移入含有Ⅳ型胶原酶 (200 U/mL,美国Sigma公司)的离心管，置于37 ℃ CO2培养箱中消化过夜。再将过夜消化后的细胞悬液离心 (147 576×g,5 min,以下同),弃去上清。然后用PBS缓冲液洗涤离心3次后加入含1%青链双抗 (美国Sigma公司)及10%胎牛血清 (FBS,美国Invitrogen公司)的BEGM培养液 (瑞士Lonza公司)收集于6 mm培养皿中,置入37 ℃ CO2培养箱中培养2～7天后取出，置于倒置相差显微镜下观察有无污染,细菌污染可见较多活动的微生物,真菌污染可见大量真菌丝,有污染的培养皿立即丢弃,重新采集标本进行同法培养。

CAFs的去除及原代LSCC细胞的传代培养培养出的原代LSCC细胞及CAFs是共生长的,当两者即将铺满培养皿底壁时需要进行胰酶消化传代培养。实验组利用差速消化法去除CAFs:吸去培养液上清,用PBS洗涤后每6 cm培养皿 (美国Corning公司)加入约1～2 mL胰酶 (美国Invitrogen公司)消化液,在相差显微镜下观察当CAFs从长梭形收缩变成椭圆形,轻轻晃动可从培养皿底部脱落时立即加入含血清的培养液2 mL终止消化,弃去消化液,用PBS洗涤3次。LSCC细胞对胰酶消化反应差,仍贴壁于培养皿中,加入BEGM培养液继续培养至汇合时可进行传代。对照组的培养皿在消化时不将CAFs去除,原代LSCC细胞及CAFs始终共同消化和接种培养。

LSCC细胞及CAFs免疫荧光鉴定将消化后收集的LSCC细胞及CAFs接种于经多聚赖氨酸处理后的载玻片 (武汉博士德生物工程有限公司),培养24 h后观察细胞已全部贴壁。弃去培养液,用PBS洗涤后置入4%多聚甲醛中固定15 min,再用10%羊血清封闭液 (含或不含0.3% Triton X-100)室温封闭40 min,随后加入如下兔抗人一抗:广谱角蛋白 (pan-CK) (1∶400;美国Abcam公司)或波形蛋白 (vimentin) (1∶200;美国Abcam公司)或α平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) (1∶200;美国Abcam公司)或成纤维细胞活化蛋白 (FAP) (1∶250;美国Abcam公司) 4 ℃过夜孵化。次日PBS洗涤玻片后置入FITC或CyTM3荧光标记的羊抗兔IgG (H+L) (1∶100,美国Jackson ImmunoResearch公司)室温避光孵化1 h。PBS洗涤后常规DAPI (武汉博士德生物工程有限公司)染核,显微镜观察及拍照。

传代培养的LSCC细胞形态学观察将去除了CAFs的LSCC细胞进行胰酶消化传代培养,用倒置相差显微镜观察每代培养的LSCC细胞的凋亡相关形态学变化并进行拍照。凋亡细胞的形态学特征为细胞由原先的鹅卵石样贴壁状态变得非常扁平,细胞周围折光度消失,最终失去贴壁能力而漂浮于培养液中。始终与CAFs共培养传代的LSCC细胞为对照。

传代培养的LSCC细胞流式细胞仪凋亡检测利用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (南通碧云天生物技术研究所)进行凋亡检测,把培养皿中的细胞培养液吸出置于离心管内,PBS洗涤3遍,加入胰酶消化液1～2 mL,显微镜下观察至细胞收缩变圆时将之前收集的培养液加入并终止消化,轻轻吹打使贴壁细胞脱落,转移到离心管内离心5 min,弃上清。PBS重悬,取5万～10万重悬细胞,离心,弃上清,加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻吹打,重悬细胞,再加入5 μL Annexin V-FITC,轻轻吹打,最后加入10 μL碘化丙啶染液,轻轻混匀。室温避光孵育15 min,随后置于冰浴中。上机进行流式仪检测。

传代培养的LSCC细胞Caspase 3表达水平的Western blot检测同上法收集悬于培养液中的细胞及贴壁细胞,离心,弃上清。加入约0.5 mL含1%PMSF的RIPA裂解液,充分吹打裂解细胞,4 ℃离心(12 000×g,5 min),取上清。BCA法进行蛋白浓度测定后进行电泳、转膜、封闭、抗体[兔抗人Caspase 3(1∶5 000,美国Abcam公司)及HRP标记羊抗兔IgG (H+L)(1∶2 000,美国Jackson Immuno Research公司)]孵育及显影。

结果

20例LSCC原代培养标本中发生污染的有4例,未污染的16例,16例中与CAFs分离后LSCC细胞单独培养均在4代以内停止生长,其中1代停止生长的5例,2代停止生长的7例,3代停止生长的2例,4代停止生长的2例,以下实验结果为4代停止生长的2例。

LSCC细胞及CAFs免疫荧光鉴定LSCC细胞为pan-CK阳性,而Vimentin阴性,表明其为上皮来源。相反,CAFs为pan-CK阴性,而Vimentin阳性,表明其为间质来源。此外CAFs为FAP及α-SMA阳性,该两种蛋白为CAFs特异性蛋白,进一步证实了其CAFs身份 (图1)。

传代培养的LSCC细胞形态学观察与CAFs分离后LSCC细胞在传代过程中形态学发生显著变化,未传代的原代LSCC细胞呈鹅卵石样贴壁生长,形态饱满,折光度好,可分散生长;传代后LSCC细胞常成簇生长,形态逐渐变得扁平,折光度下降,胞质出现较大的空泡,贴壁能力下降,最终失去贴壁能力而漂浮于培养液中。始终与CAFs共培养的LSCC细胞在传代过程中形态学无显著变化 (图2)。

传代培养的LSCC细胞流式细胞仪凋亡检测流式细胞仪检测到脱离了CAFs单独培养的LSCC细胞凋亡细胞的比例随传代而逐代增加,传至第3代时,其早期凋亡及晚期凋亡细胞的总和已达到近80%,而始终与CAFs共培养的LSCC细胞在传代过程中最终仅检测到微量凋亡细胞 (P<0.05,图3)。

传代培养的LSCC细胞Caspase 3表达水平的Western blot检测与CAFs分离培养的LSCC细胞Caspase 3蛋白表达水平随传代而逐代增加,而始终与CAFs共培养的LSCC细胞在传代过程中仅检测到微量Caspase 3表达 (P<0.05,图4)。

The LSCC cells showed positive staining of pan-CK (A) and negative staining of Vimentin (B).In addition,the CAFs showed negative staining of pan-CK (C) and positive staining of Vimentin (D), α-SMA (E),and FAP (F).

图1LSCC细胞及其相关成纤维细胞免疫细胞荧光鉴定

Fig 1Authentication of LSCC cells and CAFs using immunocytochemical staining

The LSCC cells cocultured with CAFs showed no significant morphalogical changes at primary (A), passage 1 (B), passage 2 (C),and passage 3 (D).In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed significant morphalogical changes at primary (E), passage 1 (F), passage 2 (G),and passage 3 (H) including:increasingly flattened outline,decreased capacity to attach to the flask,and increased apoptotic cells floating in the medium.Noteworthy,apoptotic cells with huge cytoplasmic vacuolewas observed (yellow arrow).

图2两种方法体外传代培养过程中LSCC细胞的形态学变化

Fig 2Morphalogical changes of LSCC cells in two differentinvitroculture systems

The flow cytometry detected consistently few apoptotic LSCC cells at primary (B), passage 1 (C), passage 2 (D),and passage 3 (E) when cocultured with CAFs.In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly upregulated proportion of apoptotic cells at primary (G), passage 1 (H), passage 2 (I),and passage 3 (J). A and F：Blank control. K and L：Statistical analysis of apoptotic cells in two different culture system.(1)P<0.05.

图3两种方法体外传代培养过程中LSCC细胞凋亡比例的变化

Fig 3Changes of apoptotic LSCC cells quantified by the flow cytometry in two differentinvitroculture systems

A：The LSCC cells cocultured with CAFs showed consistently low expression of Caspase 3 at primary,passage 1,passage 2,and passage 3. B：In contrast,the LSCC cells separated from CAFs showed increasingly enhanced expression of Caspase 3 from primary to passage 3. C and D：Statistical analysis of relative protein expression of LSCC cells in two different culture system.(1)P<0.05.

图4两种方法体外传代培养过程中LSCC细胞Caspase 3表达水平的变化

Fig 4Changes of LSCC cells Caspase 3 detected by Western blot in two differentinvitroculture systems

讨论

CAFs是近年来肿瘤研究研究的热点,文献报道的相关研究均采用实体肿瘤的细胞系进行体外培养,不同类型实体瘤中的CAFs均有部分促进相应肿瘤细胞系生长和侵袭的作用[5-7]。本文在前期研究LSCC细胞系的基础上进一步收集LSCC标本进行原代培养并分离LSCC组织中的CAFs及原代LSCC细胞,用来验证LSCC组织中的CAFs对LSCC原代细胞是否具有相似的促进生长的作用及其强弱程度。本研究所选取的20例LSCC标本原代培养未污染的16例,与CAFs分离后LSCC细胞传代过程中很快凋亡,均在4代以内停止生长,而与CAFs共培养的LSCC细胞在体外的培养活性始终无明显下降。我们分别从形态学、流式细胞仪凋亡比例检测及Caspase 3蛋白表达水平检测进一步进行了研究。

我们首先对分离培养的LSCC原代细胞及CAFs进行了免疫细胞荧光鉴定,发现LSCC细胞为pan-CK阳性,而Vimentin阴性,表明其为上皮来源,与文献报道的鳞癌免疫染色结果一致[13]。相反,CAFs为pan-CK阴性,而Vimentin阳性,表明其为成纤维细胞来源[14]。此外,根据文献报道,我们还进一步选取了FAP及α-SMA两个CAFs特异性蛋白进行染色[15],发现两种蛋白染色均为阳性,进一步证实了我们所培养LSCC组织中的成纤维细胞的确为CAFs。

我们用相差显微镜观察了LSCC细胞在脱离了CAFs后单独体外培养传代时的形态学变化,结果发现:与CAFs分离后单独培养的LSCC细胞在传代过程中很快发生凋亡,伴随着形态学的显著变化,从之前的鹅卵石样贴壁生长变得越来越扁平,胞质出现巨大空泡,并且贴壁能力明显下降,最终漂浮于培养液中。相比之下,一直与CAFs共培养的LSCC细胞在传代过程中形态学无显著变化。我们在文献中尚未见类似的形态学变化报道。

通过流式细胞仪定量检测了LSCC细胞在体外传代培养过程中的凋亡细胞比例变化发现:在有CAFs共培养的条件下,LSCC细胞在传代过程中始终仅检测到微量凋亡细胞;相比之下,无 CAFs的辅助培养,LSCC细胞在传代过程中很快凋亡,传至第3代时,其早期及晚期凋亡细胞的总和已达到近80% (P<0.05)。

最后,我们借助于Western blot对两种培养条件下的LSCC细胞Caspase 3蛋白表达水平进行了检测,发现在没有CAFs辅助培养的条件下,LSCC细胞Caspase 3蛋白表达水平随传代而逐代增加;反之,LSCC细胞在传代过程中Caspase 3表达的表达水平无明显变化,始终仅检测到微量表达 (P<0.05)。

综上所述,我们在前期实验研究结合文献报道的基础之上提出了CAFs对LSCC原代细胞的体外培养具有非常重要的抗凋亡作用的假设,通过实验设计进一步从形态学到细胞分子生物学水平进行了验证,证实了这一假设的正确性,在国内外文献中尚未见类似报道。我们的实验发现与目前文献报道的结果存在不同之处。已发表的文献发现CAFs对肿瘤细胞系起到的作用仅仅是促进部分生长和侵袭转移能力,而本文得到的结果却不仅仅是促进部分生长的能力,而是没有CAFs的辅助培养,脱离了原先肿瘤微环境的原代LSCC细胞无法存活。得出这样不同结果的原因与我们所用的材料是原代培养的LSCC细胞而不是肿瘤细胞系有关。肿瘤细胞系与原代肿瘤细胞在生物学特性上存在巨大差异,已经建成的肿瘤细胞系几乎能够无限传代而活力不减,因为它们已经经历了建系的体外培养筛选,然而大多数原代肿瘤细胞在体外培养的传代过程中增殖活性逐代下降,很快发生凋亡而在建系过程中被淘汰。例如,1973年Giard等[16]报道了200例人肿瘤标本原代培养建系工作,建成肿瘤细胞系13个,总体成功率仅约6.5%。本研究用与文献报道不同的研究材料——原代培养的肿瘤细胞,得出了与文献报道不同的研究结论，CAFs对LSCC原代肿瘤细胞适应新环境的生长起到决定性的促进生长作用而不是部分促进作用。我们认为,这样的结论应该更贴近临床LSCC患者的肿瘤侵袭转移生物学特性,为消灭临床早期转移灶的靶向治疗提供了部分实验依据。

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Laryngeal cancer associated fibroblasts promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma cellsinvitro

WANG Mei1,2▲,WU Chun-ping3▲,CAO Xiao-juan4,ZHENG Wen-wei4,FAN Guo-kang1△

(1DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310009,ZhejiangProvince,China;2DepatmentofOtolaryngology,ShanghaiMunicipalHospitalofTraditionalChineseMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200071,China;3DepartmentofHeadandNeckSurgery,EyeandENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China;4DepartmentofOtolaryngology,SecondAffiliatedHospital,JiaxingUniversityCollegeofMedicine,Jiaxing314000,ZhejiangProvince,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore whether the laryngeal cancer associated fibroblasts (CAFs) can promote the growth of primarily cultured laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) cells in vitro.MethodsTwenty LSCC specimens were collected and primarily cultured.The LSCC cells growing out of the seeded tissue fragments were separated from the CAFs by differential trypsinization and subcultured continually.The inverted phase-contrast microscope was used to observe the morphological change of the cultured LSCC cells,flow cytometry was used to quantify the proportion of Apoptotic cells,and Western blot was used to detect the protein level of Caspase 3.The LSCC cells cocultured with CAFs consistently serverd as controls.ResultsFor the LSCC cells separated from CAFs,proliferation capacity decreased rapidly in the passage culture in vitro,and the most cells were terminated within the 3 generations.The apoptotic and floating LSCC cells observed by the phase-contrast microscope,the percentage of apoptotic cells quantified by the flow cytometry,and the protein level of Caspase 3 detected by Western blot increased gradually.By contrast,no significant differences of proliferation capacity of the LSCC cells cocultured with CAFs were detected during the in vitro subculture system (P<0.05).ConclusionsThe laryngeal CAFs can promote the growth of primarily cultured LSCC cells in vitro.

【Key words】cancer associated fibroblasts;laryngeal squamous cell carcinoma;primary culture;apoptosis

(收稿日期:2015-07-24;编辑:沈玲)

【中图分类号】R739.65

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.02.009

▲Co-first authors

△Corresponding authorE-mail:fanguokang@163.com