白藜芦醇对LPS诱导HUVEC细胞线粒体跨膜电位影响研究*

唐晶　姜鲜　李茂　孙玉红　章卓△

(1.泸州医学院药学院药理教研室，四川 泸州　646000；

2.达州职业技术学院药学教研室，四川 达州　635000；

3.泸州医学院附属医院麻醉科，四川 泸州　646000)



白藜芦醇对LPS诱导HUVEC细胞线粒体跨膜电位影响研究*

唐晶1,2姜鲜3李茂1孙玉红1章卓1△

(1.泸州医学院药学院药理教研室，四川 泸州646000；

2.达州职业技术学院药学教研室，四川 达州635000；

3.泸州医学院附属医院麻醉科，四川 泸州646000)

摘要目的：探讨白藜芦醇对LPS刺激HUVEC细胞活性及线粒体跨膜电位影响。方法：体外培养HUVEC，随机分为LPS组、阴性组、白藜芦醇160、80、40、20 μg·l(-1)剂量组。其中，LPS组与白藜芦醇各组分别以1 μg·ml(-1)LPS刺激细胞24 h后，采用CCK-8法检测细胞活力，荧光显微镜下观察罗丹明染色后细胞线粒体跨膜电位。结果：白藜芦醇各组均能提高LPS诱导的HUVEC细胞存活率，提高细胞线粒体跨膜电位，与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。结论：白藜芦醇能提高LPS刺激HUVEC细胞活性，提高细胞线粒体跨膜电位。

关键词：白藜芦醇；HUVEC细胞；线粒体跨膜电位

血管内皮细胞(Vascular endothelial cell，VEC)参与了血管通透性，具有参与机体炎症反应和免疫应答，调节血管舒张、参与止血和趋化白细胞的作用[1]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)属于革兰阴性菌细胞壁的重要成分，可以通过激活多种细胞因子损伤血管内皮细胞，引起血管内皮细胞严重炎性反应[2]。而炎症所致血管内皮损伤是多种疾病和综合征发生、发展的病理基础，比如急性肺损伤、动脉粥样硬化等心血管疾病、创伤、休克、肿瘤等[2]，因此探讨寻找保护内皮损伤的措施有重要意义。白藜芦醇(Resveratro1，Res)是多年生草本植物蓼科蓼属虎杖的根茎中的提取物，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或药物中，具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等生物药理活性[3-5]。白藜芦醇对LPS致HUVEC细胞凋亡保护效应是否与细胞线粒体跨膜电位有关目前仍不清楚。据此，本文通过观察不同剂量白藜芦醇对LPS刺激下HUVEC细胞凋亡保护效应，分析其保护效应是否与影响细胞线粒体跨膜电位有关。

1材料与方法

1.1试剂

白藜芦醇(陕西森弗生物技术有限公司，批号：20081478，纯度98%)；LPS(Sigma，L2880)；HUVEC细胞(购自武汉大学CCTCC细胞库)；罗丹明123(碧云天生物技术研究所)；RPMI1640培养基，胎牛血清(Hyclone，USA)；CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)。

1.2仪器

超净工作台(苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1F型)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司，CKX41型)；酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司，DNM-9602型)；荧光显微镜(德国LEICA公司，DMR型)。

1.3CCK-8法检测白藜芦醇对LPS刺激HUVEC后细胞活性的影响

将LPS配成10 mg·ml-1母液分装后-20℃冻存备用。将白藜芦醇用DMSO与无血清培养基配成640 μg·ml-1母液(DMSO浓度小于0.1%)。HUVEC细胞株采用RPMI1640+10%胎牛血清培养。取对数生长期的HUVEC细胞，按1×105·ml-1细胞浓度接种于96孔板，每孔90 μl，培养24 h后处理。将细胞分为LPS组(1 μg·ml-1LPS+细胞)，阴性组(细胞+培养基)，空白组(仅有培养基无细胞)以调整培养基的颜色误差，白藜芦醇分为160、80、40、20 μg·l-14个剂量组(白藜芦醇+1 μg·ml-1LPS+细胞)，溶媒对照组(DMSO+细胞)加终浓度为0.1%DMSO，处理时间为24 h，加入CCK-8 10 μl继续培养1 h，酶标仪450 nm波长下检测各孔吸光度值，以OD值反应细胞活力。每个浓度3个复孔，连续重复3次。

1.4罗丹明染色检测线粒体跨膜电位

细胞分组同1.4，将不同处理后的HUVEC细胞用0.25%胰酶消化，收集1×l06个细胞，经PBS清洗2次，与1 μmol·L-1罗丹明(Rhodamine 123，Rh123)在37℃共同孵育30 min，PBS清洗2次，荧光显微镜下观察荧光强度。

1.5统计学处理

2结果

2.1白藜芦醇对LPS刺激HUVEC细胞后细胞活性影响

LPS组细胞活力明显下降，表明LPS抑制HUVEC细胞生长明显。与LPS组比较，白藜芦醇160, 80, 40与20 μg·L-1可明显提高细胞活力，有统计学意义(P<0.05或0.01)，见图1。

图1　白藜芦醇对LPS刺激HUVEC后细胞活力影响注：同LPS组比较，*P<0.05；**P<0.01

2.2白藜芦醇对LPS刺激HUVEC细胞后对线粒体跨膜电位影响

荧光显微镜结果显示，LPS组荧光较强，表明线粒体跨膜电位较低。阴性对照组荧光较弱，表明线粒体膜完整，线粒体跨膜电位较高。与LPS组比较，白藜芦醇160, 80, 40 μg·L-1剂量组荧光强度弱于模型组，提示白藜芦醇各剂量组能够提高LPS刺激HUVEC细胞后的线粒体跨膜电位，见图2。

(A)阴性组　　　　　　　　　　　　　　(B)LPS组

(C)Res 160 μg·L-1　　　　　　　　　　　(D)Res 80 μg·L-1

(E)Res 40 μg·L-1　　　　　　　　　　(F)Res 20 μg·L-1图2　白藜芦醇对LPS刺激HUVEC后线粒体跨膜电位影响(×200)

3讨论

脂多糖致血管内皮细胞凋亡机制复杂，但主要与脂多糖激活多种细胞因子，激活NF-κB，改变线粒体跨膜电位有关[6]。线粒体跨膜电位(△ψm)与细胞凋亡间关系密切。△ψm是由线粒体内膜两侧电子的不对称分布造成。正常生理情况下，线粒体内膜通透性很低，仅允许不带电荷的小分子物质通过，是维持电化学质子梯度、进行氧化磷酸化的结构基础[7]。在细胞凋亡早期，线粒体外膜对蛋白质的通透性增高，线粒体内膜的跨膜潜能降低。线粒体膜电位降低，可引起细胞凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡[8]。本实验选择罗丹明染色后荧光显微镜检测线粒体跨膜电位。Rh123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质，荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体跨膜电位破坏，Rh123重新释放出线粒体，发出强黄绿色荧光。实验结果显示，正常细胞荧光较弱，表明线粒体膜完整。LPS刺激后的HUVEC细胞荧光较强，表明线粒体跨膜电位受到破坏。白藜芦醇干预后可以明显看见荧光减弱，提示白藜芦醇减少HUVEC细胞凋亡可能是与提高线粒体跨膜电位有关。

综上可以看出，脂多糖对血管内皮细胞活性影响与线粒体跨膜电位改变有关，白藜芦醇能够改善LPS刺激HUVEC细胞后活性，可能与改变HUVEC线粒体跨膜电位有关。但由于白藜芦醇药理作用较多，涉及作用机制亦较多，因此白藜芦醇对血管内皮细胞保护作用的机制以及相关应用尚需进一步探讨和研究。

参考文献

1Maier JA. Endothelial cells and magnesium: implications in atherosclerosis[J]. Clin Sci (Lond), 2012, 122(9): 397-407.

2Noratto GD, Angel-Morales G, Talcott ST, et al. Polyphenolics from açaí(Euterpe oleracea Mart.) and red muscadine grape (Vitis rotundifolia) protect human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) from glucose and lipopolysaccharide(LPS)-induced inflammation and target microRNA-126[J]. J Agric Food Chem, 2011, 59(14): 7999-8012.

3Gresele P, Cerletti C, Guglielmini G, et al. Effects of resveratrol and other wine polyphenols on vascular function: an update[J]. J Nutr Biochem, 2011, 22(7): 201-211.

4Zeuke S, Ulmer A J, Kusumoto S, et al. TLR4-mediated inflammatory activation of human coronary artery endothelial cells by LPS[J]. Cardiovasc Res, 2002, 56(1): 126-134.

5Pirola L, Frojdo S. Resveratrol: one molecule, many targets[J]. IUBMB Life, 2008, 60(5): 323-332.

6Shi Q, Wang J, Wang XL, et al. Comparative analysis of vascular endothelial cell activation by TNF-alpha and LPS in humans and baboons[J]. Cell Biochem Biophys, 2004, 40(3): 289-303.

7Li Y, Shibata Y, Zhang L, et al. Periodontal pathogen aggregatibacter actinomycetemcomitans LPS induces mitochondria-dependent-apoptosis in human placental trophoblasts[J]. Placenta, 2011, 32(1): 11-19.

8Emre Y, Hurtaud C, Nübel T, et al. Mitochondria contribute to LPS-induced MAPK activation via uncoupling protein UCP2 in macrophages[J]. Biochem J, 2007, 402(2): 271-278.

Effects of resveratrol on mitochondrial membrane potential of HUVEC cells induced by LPS*

Tang Jing1,2, Jiang Xian3, Li Mao1, Sun Yu-hong1,2, Zhang Zhuo1△(1.Department of Pharmacology, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Department of Pharmacy, Dazhou Vocational and Technical College, Sichuan Dazhou 63500;3.Department of Anesthesia, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000)

AbstractObjective：To investigate the effects of resveratrol on the mitochondrial membrane potential of the HUVEC cells induced by LPS. Methods: HUVEC cells were cultured in vitro and divided into LPS group, normal group, 160, 80, 40, 20 μg·L-1resveratrol group. LPS group and resveratrol groups were stimulated by 1 μg·m l-1LPS for 24 h, cell viability was observed by CCK-8; mitochondrial membrane potential were tested by the fluorescence microscope. Results: Compared with model group, resveratrol at the concentration of 160, 80, 40, 20 μg·L-1could increase the cell viability and increase the mitochondrial membrane potential significantly(P<0.05). Conclusion: Resveratrol could against the apoptosis of HUVEC cell induced by LPS, and the mechanism may be associated with the increasion of the mitochondrial membrane potential.

Key Words:Resveratrol; HUVEC cell; Mitochondrial membrane potential

(收稿日期：2015-10-24)

作者简介：唐晶，女，讲师，主要从事神经药理研究，Email：498926268@qq.com。△通讯作者：章卓，男，副教授，主要从事神经与免疫药理学，Email：zhhuozhang100@163.com。

*基金项目：四川省教育厅课题(编号：14ZA0143)