气相色谱－质谱法同时测定肉制品中9种N－亚硝胺的含量

杨金川，杨莎莎，黄家岭

（贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550001）

气相色谱－质谱法同时测定肉制品中9种N－亚硝胺的含量

杨金川，杨莎莎，黄家岭＊

（贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550001）

为有效保障肉制品的食品安全，建立适用固相萃取－气相色谱－质谱（SPE－GC－MS）同时测定肉制品中N－二甲基亚硝胺（NDMA）、N－甲基乙基亚硝胺（NMEA）、N－二乙基亚硝胺（NDEA）、N－二丙基亚硝胺（NDPA）、N－二丁基亚硝胺（NDBA）、N－亚硝基哌啶（NPIP）、N－亚硝基吡咯（NPYR）、N－亚硝基吗啉（NMOR）及N－二苯基亚硝胺（NDPhA）等9种N－亚硝胺的方法，考察样品不同提取试剂、不同固相萃取小柱、不同色谱条件对分离检测的影响。结果表明：样品经过乙腈提取、固相萃取柱净化，采用GC－SIM－MS检测，外标法定量，在10～400μg／L，线性相关系数达0．995 3以上，检出限（LODs）低于0．04μg／kg；在添加水平约为2．67μg／kg时，该方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相对标准偏差在3．55%～5．98%。该方法简便、快速，具有良好的灵敏度、重复性，可适用于同时测定肉制品中9种N－亚硝胺类化合物的含量。

N－亚硝胺；气质联用；肉制品

N－亚硝胺类化合物是一种强致癌物，在迄今发现的亚硝胺类化合物中，有90%的硝胺类物质可以诱发动物器官的癌变肿瘤。N－亚硝胺易溶于有机溶剂，除少量的N－亚硝胺（如N－二甲基亚硝胺、N－二乙基亚硝胺及某些N－亚硝基氨基酸）可溶于水外，大多数都不溶于水。在通常情况下，N－亚硝胺类化合物不易水解，在中性和碱性环境中较稳定，但在酸性溶液及紫外线照射下可缓慢分解［1－2］。

食品中天然存在的N－亚硝胺类化合物含量极低，但其前提物质亚硝酸盐（NaNO2）和胺类广泛存在于自然界中。亚硝酸盐和硝酸盐广泛应用于肉制品的生产中，其具有抑制肉毒梭菌产生肉毒毒素的作用，赋予肉制品特有的颜色、风味和质地，抑制肉制品贮藏过程中的过热味和腐败味。但过量的使用NaNO2，会存在安全隐患。亚硝酸盐能与胺类物质在适宜的条件下反应产生致癌性的亚硝胺。亚硝胺通过参与体内代谢，诱发有机体突变，而产生致畸性和致癌性［3］。食物中，亚硝胺的含量很低，但基质的成分却十分复杂，有时会干扰亚硝胺的分析检测，必须预先去除。目前，亚硝胺的测定主要通过水蒸气蒸馏－液液萃取［4］、固液萃取提取［5－6］，液相色谱－质谱法（HPLC－MS）［78］、气相－热能分析仪（GCTEA）［9］、气相色谱－质谱法（GC－MS）［10］等检测。由于肉类基质的复杂性和亚硝胺的含量较低等特点，目前对肉制品中N－亚硝胺类化合物的检测鲜见报道。为有效保障肉制品的食品安全，建立GC－MS方法，对传统肉制品N－二甲基亚硝胺（NDMA）、N－甲基乙基亚硝胺（NMEA）、N－二乙基亚硝胺（NDEA）、N－二丙基亚硝胺（NDPA）、N－二丁基亚硝胺（NDBA）、N－亚硝基哌啶（NPIP）、N－亚硝基吡咯（NPYR）、N－亚硝基吗啉（NMOR）及N－二苯基亚硝胺（NDPhA）9种N－亚硝胺的含量进行检测，为保障肉制品的安全提供保障。

1材料与方法

1．1试验材料

肉制品：贵州4种常见肉制品腊肉、香肠、牛肉干、酱卤肉（市场随机抽取具有代表性的样品）。

仪器：气相色谱－质谱联用仪（Agilent GC7890／MS5975C，美国安捷伦公司），震荡混匀器（Multi－Reax，Heieloph公司），超声仪（SB25－12DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司），冷冻离心机（Allegra X－22R，美国贝克曼库尔特公司），数显混匀仪（IKA MS3，KA公司），旋转蒸发仪（BUCHI R－210型，瑞士BUCHI公司）。

试剂：乙腈（分析纯），二氯甲烷（色谱纯），无水硫酸钠（分析纯），9种N－亚硝胺混合标准溶液2 000mg／L（上海安普试剂有限公司）。

1．2样品处理

称取15．00g粉碎肉制样品于50mL具塞离心管中，加入20mL优选出的提取剂，涡旋震荡提取2min，再超声提取20min，于高速离心机中（低温－5℃，5 000r／min）离心10min，取出上清液于100mL梨形瓶中，底物用20mL提取剂重复提取1次，离心合并上清液，于40℃水浴旋转浓缩至10mL左右，待净化。将上述浓缩液淋洗前处理优选出的固相萃取柱，去水收集滤液，在优选出的最佳淋洗剂用量下用二氯甲烷分3次清洗旋蒸瓶，并过柱，将收集液与40℃水浴旋转蒸发近干，用提取剂定容至1．00mL，过0．45μm滤膜后待检测。

1．3测定及提取条件的考察

程序升温：进样口温度250℃，不分流进样，进样体积1μL，载气流速1．50mL／min，起始温度40℃为固定条件，分别考察升温速率为5℃／min、10℃／min和15℃／min对待测9种N－亚硝胺的分离效果。

色谱柱：在载气为He，纯度≥99．999%；气体流速1．50mL／min，尾吹气（He）60mL／min，不分流进样，进样体积1μL；最佳程序升温条件下考察非极性柱HP－5MS（30m×0．250mm×0．25μm）和强极性柱HP－INNOWAX（60m×0．250mm× 0．25μm）的分离效果，进样口温度250℃。

提取剂：样品中加入适量N－亚硝胺混合标样溶液，以乙腈和二氯甲烷作为提取剂，采用1．2中样品处理过程，分别考察对9种待测物的提取效果。

固相萃取小柱：样品中加入适量N－亚硝胺混合标样溶液，采用1．2中的处理过程，比较C18Cartridges柱（C18柱）、Florisil柱（FL柱）和活性碳小柱（活性碳柱）3种固相萃取柱的萃取效果，以每种萃取小柱所萃取9种亚硝胺的回收率来确定最佳萃取小柱。

淋洗剂用量：选用提取效果最佳的提取剂作淋洗剂，样品中加入适量N－亚硝胺混合标样溶液，采用1．2中的处理方法，同时选用5mL、8mL、10mL、12mL、15mL和20mL提取剂用量，比较萃取效果。

1．4质谱条件

离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度240℃；电子轰击（EI）离子源，电子能量70eV；采集模式：选择离子扫描（SIM）模式，扫描质量范围30～450m／z，阈值150，溶剂延迟11min。

1．5标准溶液的制备

以乙腈为溶剂，将质量浓度为2 000mg／L的9 种N－亚硝胺类化合物母液，先稀释成质量浓度为20mg／L的标准溶液，再将其稀释成质量浓度为10μg／L、20μg／L、50μg／L、100μg／L、200μg／L和400μg／L的一系列标准工作溶液。在上述色谱条件进行测定，以目标物定量离子的峰面积（y）为纵坐标，进样浓度（x）为横坐标，进行线性回归分析，得到9种N－亚硝胺类化合物在10～400μg／L的线性关系。

1．6样品的添加回收

称取粉碎的腊肉样品15．00g，于50mL具塞离心管中，加入200μg／L的9种N－亚硝胺类化合物混合标准溶液（添加水平约为2．67μg／kg）200μL，按1．2节的方法进行加标回收试验，平行进行5次样品测定，同时做空白样品试验，检测其本底成分。

1．7肉制样品的检测

通过市场监管，随机抽取具有代表性的4种贵州常见肉制品腊肉、香肠、牛肉干和酱卤肉，采用1．2的方法处理4种样品，每个样品平行测定3次，检测9种N－亚硝胺类化合物的含量。

2结果与分析

2．1色谱分离效果

2．1．1程序升温 结果显示，当升温速率分别为5℃／min和10℃／min时，各个目标化合物能够有效分离，而升温速率为15℃／min时，MEMA与NDEA色谱峰的分离效果不佳，在考虑时间成本的情况下，因此选择升温速率为10℃／min。当柱温升高到110℃时，NDMA、NEMA、NDEA和NDPA的色谱峰已出峰。为提高分析速度，再将升温速率提高至15℃／min，待NDBA、NPIP、NPYR、NMOR色谱峰流出后，进一步将升温速率提高至40℃／min，分析最后一个目标物NDPhA。反复试验最终确定升温程序为初温40℃，保持3min，以10℃／min升至110℃，以15℃／min升至200℃，再以40℃／min升至240℃，保持10min。在该色谱条件及1．4的质谱条件下，9种N－亚硝胺有较好的分离效果（图1），9种N－亚硝胺的保留时间、定性和定量离子见表1。

表1 GC－MS测定9种N－亚硝胺类化合物的保留时间、定性及定量离子Table 1 Retention time，qualitative and quantitative ions of 9N－nitrosamines by GC－MS

图1 标准溶液（200μg／L）9种N－亚硝胺混合的总离子流图谱Fig．1 Total ion current spectrogram of 9N－nitrosamines standard solutions（200μg／L）

2．1．2色谱柱 试验表明，选用HP－5MS时，色谱峰分离效果不好，NDMA、NEMA、NDEA的色谱峰没有完全分开；而选用HP－INNOWAX时，获得的色谱峰峰形对称、定量准确、重现性好、分离效果好。因此，试验选用HP－INNOWAX作为色谱柱。

2．2提取净化条件

2．2．1提取剂 试验发现用二氯甲烷作为提取剂，提取肉制品时会提取出大量的脂肪，而提出的脂肪不容易除去，因此不适宜提取脂肪含量高的样品；用乙腈作为提取剂时，可以有效减少肉制品中脂肪的提出 （含水量较高的肉制品可以适量加入NaCl），因此，试验采用乙腈作为提取溶剂。

2．2．2固相萃取柱 由图2可知，3种小柱均有较好的萃取回收效率，且活性碳小柱萃取回收效果最好，综合考虑对脂肪和色素的去除，最终选活性炭小柱为固相萃取小柱。

2．2．3淋洗剂的用量 由图3可知，随着淋洗剂用量的增加，回收效率也随之增加，但当用量达15mL后，回收效率增加不明显，所以确定淋洗剂的最佳用量为15mL。

2．3方法的标准曲线与检出限

由表2可知，该试验方法重现性好，线性范围广，线性相关系数（R2）达0．995 3以上；灵敏度高，除NDPhA的检出限（LOD）为0．02μg／kg外，其他几种N－亚硝胺类化合物的LOD均在0．03～0．04μg／kg。

2．4精密度与回收率

由表3可知，该方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相对标准偏差（RSD）在3．55%～5．98%，表明该方法具有良好的精密度、准确性和重现性，可用于同时测定肉制品9种N－亚硝胺类化合物的含量，满足GB 2762—2012规定的要求。

图2 不同固相萃取柱下9种N－亚硝胺的回收率Fig．2 Recovery of 9N－nitrosamines under different solid phase extraction condition

图3 不同体积下二氯甲烷淋洗的回收率Fig．3 Recovery of mixed N－nitrosamines standard solution under different methylene chlotide volume elution condition

表2 10～400μg／L线性范围9种N－亚硝胺的线性回归方程、相关系数及检出限Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient（R2）and detection limit of 9N－nitrosamines with 10～400μg／L

表3 9种N－亚硝胺的加标回收率与相对标准偏差（n＝5）Table 3 Standard addition recovery and relative standard deviation of 9N－nitrosamines

表4 肉制样品中9种N－亚硝胺的实际含量（n＝3）Table 4 Actual content of 9N－nitrosamines in meat product samples

2．5样品的测定

试验表明：1）横向上看，检出率最高的是NDPA，在分析的4种肉制品中，均检出，且含量较高（4．99～7．94μg／kg）；其次是NMOR，除牛肉干外也均有检出；个别检出的化合物还有NDMA、NDBA、NPYR和NDPhA；只有NEMA、NDEA和NPIP在所有肉制品中均检出。2）纵向上看，除牛肉干外其他3种肉制品中N－亚硝胺类化合物总含量均大于10μg／kg（表4）。根据我国食品中污染物限量（GB 2762－2012），肉及肉制产品中只有NDMA有限量标准（≤3．0μg／kg）规定，除腊肉NDMA的检出量为1．79μg／kg（小于限量标准3．0μg／kg）外，其他样品NDMA未检出，均可判定合格。

3结论

试验建立了气相色谱－质谱联用快速测定肉制品中9种N－亚硝胺类化合物含量的分析方法。结果表明，样品经过乙腈提取、固相萃取柱净化，采用GC－SIM－MS检测，外标法定量，在10～400μg／L，线性相关系数达0．9953以上，检出限（LODs）低于0．04μg／kg；在添加水平约为2．67μg／kg时，该方法的平均回收率在82．64%～98．24%，相对标准偏差在3．55%～5．98%。该方法与国家标准方法（GB／T5009．26－2003）相比，前处理简单快速，易于操作，重现性好，灵敏度高，适用于肉制品的快速批量分析检测，可为肉制品质量的判定提供参考依据，在对4种肉制品的检测中，除牛肉干外，其他肉制品中N－亚硝胺总含量都比较高，均超过10μg／kg，这可能与产品类型及加工方式等有关。

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（责任编辑：孙小岚）

农业信息·农业工程·资源环境

Agricultural Information and Technology·Agricultural Engineering·Resource and Environment

Determination of Nine N－nitrosamines Content in Meat Products by GC－MS

YANG Jinchuan，YANG Shasha，HUANG Jialing＊

（Guizhou Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Guiyang，Guizhou550001，China）

Nine N－nitrosamines of NDMA，NMEA，NDEA，NDPA，NDBA，NPIP，NPYR，NMOR and NDPhA in meat products were detected simultaneously by the established suitable SPE－GC－MS to study the effect of different extract reagents，solid phase extraction column and chromatographic condition on separation determination of nine N－nitrosamines for effectively safeguarding food safety of meat products．Results：The linear correlation coefficient and detection limit of the samples within 10～400μg／L are above 0．995 3and below 0．04μg／kg after acetonitrile extraction，solid extraction column purification，GC－SIM－MS detection and external standard methods．The average recovery and RSDof the samples are 82．64%～98．24%and 3．55%～5．98%respectively when the adding level is about 2．67μg／kg．The established SPE－GC－MS method with advantages of simplicity，rapidity，good sensitivity and repetition should be used in simultaneous detection of nine N－nitrosamines content in meat products．

N－nitrosamines；GC－MS；meat product

S851．34＋7；O657．63

A

1001－3601（2016）11－0486－0155－04

2016－05－02；2016－11－05修回

贵州省检测能力扩展专项（201401013）

杨金川（1984－），男，工程师，从事食品分析研究。E－mail：yangjinchuan1984＠163．com

＊通讯作者：黄家岭（1982－），男，工程师，从事食品分析研究。E－mail：2225350312＠qq．com