生物监测方法在环境监测中的应用

■李越

（包头市环境监测站内蒙古包头014060）

生物监测方法在环境监测中的应用

■李越

（包头市环境监测站内蒙古包头014060）

总结了近年来现代生物技术在环境领域的应用情况，着重介绍了现代生物技术在环境监测与评价、环境工程领域的新型实用成果，并就该技术在环境领域的应用前景和发展趋势进行了分析。

现代生物技术 环境监测 生物传感器 PCR

现代生物技术是指以 DAN 技术为先导，包括微生物工程细胞工程、酶工程、基因工程、蛋白质工程和生物修复技术在内的一系列生物高新技术的统称。现代生物技术与其他高新技术产业一样具有效益高、开发周期短的特点，现已经过了基础理论研究发展阶段，自 70 年代末以来，已开始了大规模工程应用的实用阶段。现代生物技术不仅广泛应用于食品工业、高新技术农业、药品和发酵工业，而且在日益严重的环境污染的监测评价与防治等方面发挥着不可替代的作用。可以预言，在今后的一段时间内，现代生物技术将成为环境科学领域重点开发和应用的技术手段。

1 生物传感器

随着科技的发展，以及各学科的融合交叉，以 DNA 重组技术为标志的现代生物技术正被利用到环境监测领域，构成了现代生物监测技术。在环境监测领域，现在广泛使用的生物监测技术主要是将生物反应转化为电信号的生物传感器。

生物传感器是以固定化细胞核、固定化酶技术为基础，以生物学元件作为功能性识别元件，识别和感知目的被测物并将其按一定规律转化为可识别信号的器件或装置，其工作原理是：生物组分与待测对象发生相互作用，通过电子组分将待测对象检出并转化为可测量的电子信号。

生物传感器在环境监测中起着越来越重要的作用。固定化生物层与目标污染物之间的专一性作用是设计生物传感器的理论基础，基于生物催化（酶、微生物等）和免疫原理的生物传感器已在环境领域中获得了广泛应用。然而利用核酸探针为敏感元件的传感器在环境监测中开发应用尚处于起步阶段。分子生物学与生物技术的进展为研究DNA 生物传感器提供了可能。与酶和抗体不同，核酸识别层十分稳定，并且易于合成或再生以供重复使用。DNA 生物传感器为生物传感器家族中添加了新的成员，DNA 传感器的实现需要正确地选择核酸探针及其固定化和 DNA 识别信号的有效转换与检测。毫无疑问，随着该项技术的不断深入研究和日臻成熟，DNA 生物传感器将成为环境污染监测领域中的一个重要手段。

2 PCR技术

PCR 技术模拟 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的引物，该原理主要包括 3 个基本反应过程：变性———退火———延伸。变性主要是指双链 DNA 的变性，即双链 DNA 经加热至93℃左右，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链 DNA成为单链，以便与引物结合。退火是指单链 DNA 在温度降低时与引物的复性（称为退火）。在此过程中，引物与单链 DNA 模板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与 DNA 模板按碱基互补的原则配对后，在 TaqDNA聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模板 DNA 链互补的新链。经重复循环变性———退火———延伸 3 个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一次循环需2￣4min，2￣3h 就能将目的基因扩增、放大几百万倍。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCR 几小时便可完成。PCR 技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业，并被迅速推广和应用到其他领域。

在众多的污染物中，生物污染（病原菌、病毒及其它一些有害生物）直接威胁着人类的健康。传统的检测方法需要对样品进行分离培养，往往要花上几天乃至数周的时间，而且有些致病菌或病毒难以人工培养，给检测带来困难，而 PCR 技术的应用，克服了上述不足。与传统生物检测方法相比，PCR 方法不仅检测时间短、灵敏度高，还可以检测出一些依靠培养法不能检测的微生物种类。PCR方法已经在微生物检测中有了比较深入而广泛的研究，并取得了较好的应用成果。

PCR 技术反应能够被自然界中一些物质所抑制，例如胡敏酸、富里酸、某些离子及糖类物质等可以干扰 Taq 聚合酶的作用。同样，环境水样在浓缩、保存和提纯过程中可能从环境及中间处理环节带来一些潜在的 PCR 反应抑制剂，例如 EDTA、十二烷基硫酸钠等；另外还可能有一些共存物质抑制 PCR 反应。这些抑制剂一方面可能抑制 PCR反应，另一方面还可能造成假阳性结果。因而，研究环境样品中待扩增DNA 或 RNA 的提纯技术以消除抑制物的影响是十分重要的。由于DNA 的检测并不意味着必须使用活细胞，因而任何可以提供核酸物质的样品都可以进行PCR 扩增，也就是说 PCR 不能区分活细胞和死细胞，尤其是在水体卫生学检验中不能确定所检出的病毒粒子是否具有感染能力，这是一个待解决的问。

近些年来，基于 PCR 的基本原理，许多学者充分发挥创造性思维，对 PCR 技术进行研究和改进，使 PCR 技术得到了进一步地完善，并在此基础上派生出了许多新的 PCR 技术，如荧光 PCR、反转录PCR、原位 PCR、单细胞 PCR 等，以及这些技术相互融合，为生命科学领域的研究打开了一扇扇新大门，为分子生物学研究的深入开展提供了高质量的技术保障，也为环境保护提供了方便、快捷、灵敏的检测手段。

3 生物芯片（Bioships）

生物芯片是一种通过微加工技术和微电子技术将生物探针分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因组 DNA、多肽、抗原、抗体等）固定在硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质表面而构建的微型生物化学分析系统，可以对细胞、蛋白质、DNA 以及其他生物组分进行准确、快速和大信息量的检测。

在环境监测和环境保护上，可以利用生物芯片快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害。在环境监测方面的应用主要有：水质控制、检测药物、食物添加剂或化学物质毒性以及环境中有害细菌的监测。利用生物芯片技术能够同时快速地检测多种环境中的常见致病菌。

4 PCR- DGGE 技术

由于 DNA 分子中 AT 碱基对与 GC 碱基对的键间结合力的不同，造成不同序列的 DNA 分子的解链温度不同，解链需要的变性剂的浓度也不同。当 DNA 分子在含梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，序列不同的 DNA 片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性，形成向三个方向延伸的片段，这种形状的DNA 分子电泳迁移速度相应降低很多，这样不同序列的 DNA片段滞留于凝胶的不同位置，染色后会看到形成一条条的谱带。

为调节目的序列的解链程度，取得好的分离效果，通常采用 GC夹板的形式，在 PCR 引物的 5 末端连接上一段长度为 30￣50 碱基富含GC 的核苷酸序列，使相差一个碱基的序列也能分辨分离。该技术主要包括 6 个步骤：（1）样品总 DNA 提取；（2）样品 16SrDNA 片段的 PCR 扩增及纯化；（3）制胶；（4）样品的 DGGE 分析；（5）染色；（6）割胶测序。

由于 PCR－ DGGE 技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muyzer等开辟了 DGGE 在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外 DGGE 技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究。

PCR－ DGGE 技术只能分离较小的片段（达 500bp），较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。由于某些种类 16SrDNA 的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致细菌数量的过多估计。在有些情况下，不同类型的细菌种群 16SrDNA 有着相同的迁移行为，一条DGGE 条带是由不同细菌种群序列组成，这可能会低估环境微生物的种群多样性。

随着科学技术的不断发展，环境监测技术也在向更精细、更准确、更灵敏的方向发展。同时，生物技术在环境监测领域中日趋重要的地位和作用，充分说明拓宽学科的研究领域，加强学科间的交流、渗透和合作，对于科学的整体发展和进步是至关重要的。

[1]李宗义,邵强,郭伟云等.用于环境监测的生物传感器 [J].生物技术.2005.15(4): 95-98.

[2]王建龙.DNA生物传感器在环境污染监测中的应用 [J].生物化学与生物物理进展. 2001.28(1):125-127.

[3]邓小红,任海芳.PCR技术详解及分析 [J].重庆工商大学学报 (自然科学版). 2007.24(1):29-33.

X83[文献码]B

1000-405X（2016）-5-415-2