阴虚动风证帕金森病异动症大鼠大麻素CB1受体变化及复方地黄方的干预作用

滕龙，洪芳， 何建成

(1.上海中医药大学，上海　201203; 2.浙江医院，浙江，杭州　310013)



研究报告

阴虚动风证帕金森病异动症大鼠大麻素CB1受体变化及复方地黄方的干预作用

滕龙1，2，洪芳1， 何建成1

(1.上海中医药大学，上海201203; 2.浙江医院，浙江，杭州310013)

【摘要】目的 探讨阴虚动风证帕金森病(PD)异动症(LID)大鼠纹状体内大麻素CB1受体的表达及复方地黄方的干预作用。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)偏侧损毁黑质制备帕金森病大鼠模型，进一步腹腔注射左旋多巴+苄丝肼(50 mg/kg 左旋多巴和12.5 mg/kg苄丝肼)制备LID大鼠模型，并随机分为LID组、复方地黄方组，另取正常对照组、假手术组大鼠为对照，每组6只。分别在4周、6周进行神经行为学检测后，处死大鼠并取纹状体，应用Western blot法测定各组大鼠纹状体内大麻素CB1受体的表达情况。结果LID大鼠随造模时间延长，AIM评分呈增加趋势(P<0.05)，旋转启动时间呈缩短趋势(P>0.05)，旋转持续时间呈增加趋势(P<0.01)，剂峰旋转圈数呈减少趋势(P>0.05)，复方地黄方可改善上述变化。LID大鼠大麻素CB1受体表达增加，且随造模时间延长呈现减少趋势(P<0.01)，而复方地黄方干预后大麻素CB1受体的表达呈现逐渐增加的趋势(P<0.01)。结论LID模型大鼠大麻素CB1受体的含量明显升高，其变化能够较好的反映阴虚动风证的严重程度，复方地黄方干预LID模型大鼠可能是通过激活纹状体内大麻素CB1受体，抑制兴奋性氨基酸(主要是谷氨酸)的释放和诱导细胞发生级联反应来减弱神经元的兴奋性，从而起到减轻L-dopa的兴奋毒性的作用。

【关键词】帕金森病；异动症；阴虚动风证；大麻素CB1受体；复方地黄方

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是好发于中老年人的中枢神经退行性疾病，主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺(dopamine，DA)能神经元退行性变，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍为典型症候群。左旋多巴(L-dopa)是治疗PD的“金标准”药物，但长期使用可引起各种运动并发症，较为突出者如异动症(levodopa-induced dyskinesia，LID)，给PD患者的生活带来了很大的困扰[1-2]。中医学的研究成果和可靠的疗效为PD患者的临床治疗带来了一线曙光。众多的研究证明，中医药不仅可以提高PD的临床疗效，同时可降低L-dopa诱发的LID等并发症[3]。我们前期遵循循证医学原则，从文献整理入手，发现PD及LID在中医学中以阴虚动风证为多[4]，复方地黄方便是以此为理论依据，并结合临床体会，研制而成的具有滋肾补肝、平肝熄风等作用治疗PD及LID的中药复方(已获国家发明专利，ZL200810043734.2)，临床应用取得了满意疗效[5-6]。

我们课题组前期曾采用2点法偏侧注射6-OHDA损毁黑质，进一步腹腔注射L-dopa+苄丝肼2周，成功制备了阴虚动风证帕金森病LID大鼠模型[7]，并在此基础上开展了相关机理和物质基础的研究。新近的研究发现，以大麻素系统为代表的非多巴胺代偿机制在PD及其LID的发生发展过程中起着重要作用，大麻素CB1受体的研究得到了国内外学者的极大关注[8]。本研究在前期研究的基础上，研究大麻素CB1受体在PD异动症模型大鼠纹状体内的表达及复方地黄方的干预作用，籍以探寻中医药治疗PD及LID机理及内在基础，为今后的临床研究提供思路。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级SD大鼠，4～6周龄，雄性，体重180～200 g，120只，来源于上海中医药大学实验动物中心【SCXK(沪)2012-0002】。动物饲养在上海中医药大学实验动物中心，恒温(23±2)℃，相对湿度60%～65%，动物摄食、饮水及活动自由。无菌手术在上海中医药大学实验动物中心进行【SYXK(沪)2014-0008】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2主要药物

6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)：美国Sigma公司产品；阿扑吗啡(apomorphine，APO)：美国Sigma公司产品；抗坏血酸：美国Sigma公司产品；美国Sigma公司产品；左旋多巴干粉：美国Sigma公司产品(批号:192K1885)；苄丝肼：美国Sigma公司产品(批号：BCBB8323)。复方地黄方(由熟地黄、白芍、钩藤、丹参、全蝎等组成)。按既定工艺煎煮成汤药，浓度为5.18 g/mL，由上海雷允上药材有限公司代加工。大鼠中药的每日用量，按孙瑞元方法计算[9]。DB=DA×KB/KA, DB：标准体重大鼠每日用量，DA：标准体重成人每日用量，KB：大鼠剂量折算系数(7)，KA：成人剂量折算系数(388)。即：大鼠每日用量DB = DA×7/388。

1.1.3主要试剂

抗体(anti-cannabinoid receptor 1)：美国Abcam公司产品(货号：ab23703)；β-actin(内参)：美国CST公司产品(货号：#4970)；山羊抗兔二抗：碧云天公司产品。

1.1.4主要仪器

大鼠脑立体定位仪：RWD-68003型，深圳瑞沃德生命科技有限公司；分析天平：Sartorius Anglytic，910324；Western blot电泳及转膜装置：美国Bio-Rad公司；超速离心机：LE80K型，Beckman公司产品。

1.2阴虚动风证LID大鼠模型制备

动物术前按常规进行行为测试，确认无异常旋转行为后，用3%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民等[10]著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μL微量进样器将6-OHDA(溶于含0.2%维生素C的生理盐水中，即秤量药品抗坏血酸0.001 g，溶于生理盐水0.5 mL中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针)，每孔3 μL，注射速度为1 μL/min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组只注射0.2%维生素C的生理盐水，正常对照组只捆绑动物，不作任何处理。10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以旋转圈数平均>每分钟7次者为合格的PD模型[11]。

将成功PD模型大鼠给予腹腔注射L-dopa + 苄丝肼(50 mg/kg L-dopa和12.5 mg/kg苄丝肼，即L-dopa和苄丝肼溶于含0.05%的乙醇和0.1%的抗坏血酸的注射用水中，配成10 mg/mL)，每日两次，连续2周。正常对照组、假手术组给予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗坏血酸的注射用水，每日两次，连续2周。2周后诱发动物，具有典型AIM(AIM评分大于20分)表现，且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者，为阴虚动风证LID模型[12]。

1.3分组及给药

1.3.1分组方法

采用区层随机法，将阴虚动风证LID模型大鼠随机分为4组：阴虚动风证LID4周、6周模型组、复方地黄方4周、6周组，每组各6只。另取正常对照4周、6周组、假手术4周、6周组，每组各6只。

1.3.2给药方法

阴虚动风证LID模型组大鼠在腹腔注射L-dopa + 苄丝肼(50 mg/kg L-dopa和12.5 mg/mL苄丝肼)的基础上给予生理盐水灌胃；复方地黄方组大鼠在腹腔注射L-dopa + 苄丝肼的基础上给予中药复方地黄方灌胃；正常对照组、假手术组给予腹腔注射等量的含0.05%的乙醇和0.1%的抗坏血酸的注射用水的基础上给予生理盐水灌胃。每次每鼠灌胃量为2 mL，每日1次，分别连续用药4周、6周。

1.3.3样本处理

(1)取大鼠纹状体

每组大鼠进行最后一次行为学检测后，给3%戊巴比妥钠进行麻醉，迅速开颅取脑，在冰上小心分离纹状体并称重，分别置于事先准备好的冻存管中，投入液氮罐中快速冷冻，后存放于-80℃冰箱中保存，备用。

(2)实验步骤

实验步骤主要有提取总蛋白，配制分离胶和堆积胶，加样，电泳，转膜，封闭，加入抗体，显影，分析。

1.4观察指标

1.4.1阴虚动风证LID大鼠神经行为学观察

LID大鼠模型的行为学观察内容主要有异常不自主动作(abnormal involuntary movement，AIM)评分、旋转启动时间、剂峰旋转圈数、旋转持续时间。

(1)AIM评分

大鼠于注射L-dopa 4周、6周后进行AIM评分，每次评定结果由经用药后每间隔35 min的AIM总分数组成，每次连续评定4组数据，持续140 min，4次评分之和为最终得分。

(2)L-dopa诱导后对侧旋转行为的评定

大鼠在腹腔注射L-dopa一日量后进行行为学观察，记录应用L-dopa后旋转启动时间、剂峰旋转圈数以及旋转持续时间。

1.4.2阴虚动风证LID大鼠纹状体内大麻素CB1受体的变化

应用Western blot法和测定各组大鼠纹状体内大麻素CB1受体的表达情况。

1.5统计学处理方法

2结 果

2.1阴虚动风证LID模型大鼠神经行为学的变化及复方地黄方的干预作用

阴虚动风证LID模型大鼠随造模时间的延长，其AIM评分呈逐渐增加的趋势，造模6周与4周时相比，差异有显著性(P<0.05)；复方地黄方干预4周、6周后，与LID模型组相比较，差异有显著性(P<0.001)。复方地黄方组随着干预时间的延长，旋转启动时间呈逐渐增加的趋势，6周时与4周时相比较，差异有显著性(P<0.05)；复方地黄方组干预6周与LID模型组6周相比较，差异有显著性(P<0.01)。

阴虚动风证LID模型大鼠旋转持续时间随造模时间的延长，有增加的趋势，造模6周与造模4周相比较，持续时间有增加，差异有显著性(P<0.01)；复方地黄方组随干预时间的延长，大鼠旋转持续时间呈逐渐缩短趋势，6周与4周比较，差异有显著性(P<0.01)；复方地黄方干预4周、6周后与LID模型组相比较，差异有显著性(P<0.01，或P<0.001)。见表1。

表1　复方地黄方干预后阴虚动风证LID模型大鼠神经行为学的变化±s)

注：组间比较：与LID模型组比较：■P<0.01■■P<0.001；组内比较：与4周组比较：◆P<0.05◆◆P<0.01。

Note. Intergroup comparison: vs. the model group:■P<0.01■■P<0.001. Intragroup comparison: vs. the 4 weeks group after treatment:◆P<0.05◆◆P<0.01.

2.2复方地黄方干预后阴虚动风证LID模型大鼠纹状体内CB1受体表达情况

阴虚动风证LID模型组大鼠纹状体内CB1受体与内参蛋白条带密度比值较正常对照组、假手术组相比较，均明显升高，差异有显著性(P<0.001)；阴虚动风证LID模型6 周组较4 周组相比较，大鼠纹状体内CB1受体与内参蛋白条带密度比值明显降低，差异有显著性(P<0.001)。复方地黄方4 周组与LID模型4 周组比较，差异有显著性(P<0.01)；复方地黄方6 周组与LID模型6周组比较，差异有显著性(P<0.001)。复方地黄方6 周组较4 周组相比较，大鼠纹状体内CB1受体与内参蛋白条带密度比值升高趋势更明显，差异有显著性(P<0.001)。见表2、图1。

表2　复方地黄方干预后LID模型大鼠纹状体内CB1/GAPDH的比较

注：组间比较：与正常对照组比较：■P<0.001；与假手术组比较：▲P<0.001；与LID模型组比较：★P<0.01★★P<0.001。 组内比较：与4周组比较：●P<0.001。

Note. Intergroup comparison: vs. the control group：■P<0.001; vs. the sham operasted group:▲P<0.001；vs. the model group:★P<0.01★★P<0.001. Intragroup comparison: vs. the 4 week group:●P<0.001.

注：1：正常对照4周组；2：正常对照6 周组；3：假手术4 周组；4：假手术6 周组；5：LID模型4周组；6：LID模型6 周组；7：复方地黄方4 周；8：复方地黄方6周组。图1　Western blot法显示各组大鼠纹状体内CB1受体表达量的变化Note. 1: Control group at 4 weeks after treatment: 2: Control group at 6 weeks after treatment; 3: Sham operated group at 4 weeks after treatment; 4: Sham operated group at 6 weeks after treatment; 5: Model group at 4 weeks after treatment; 6: Model group at 6 weeks after treatment; 7: Compound formula rehmannia group at 4 weeks after treatment; 8: Compound formula rehmannia group at 6 weeks after treatment.Fig. 1　Western blot shows the changes of CB1 receptor expression in the rats of each group

3讨论

LID模型大鼠出现不自主的神经行为学表现是L-dopa产生神经毒性的结果。我们的实验研究也证实了L-dopa具有神经毒性。最近的大量研究表明，PD及LID的发生与大麻素受体的改变关系密切[13]。目前已知的大麻素受体主要分为CB1和CB2两种受体，两者均为G蛋白偶联受体[14]。CBl受体主要分布在中枢神经系统(主要在基底节区含量丰富)，并在GABA及谷氨酸神经元突触末梢表达。其配体为eCB，主要由突触后神经元按需合成，并且与经典的突触传递相反的方式作用于突触前膜的CBl受体，反馈性的抑制突触前的GABA及谷氨酸神经递质的释放，对运动活动进行调控[15]。PD和LID模型大鼠其表现出的神经行为学变化与纹状体内CB1受体的表达密切相关。当CB1受体被激活后，会明显改善帕金森病LID大鼠的神经行为学表现，神经行为学的严重程度与纹状体内CB1受体的表达呈现负相关。神经行为学表现越严重，其纹状体内CB1受体的表达越低。反之，神经行为学表现越轻，其纹状体内CB1受体的表达越高。

有报道显示，当长期使用L-dopa来治疗的PD动物模型诱发LID后，纹状体内CB1受体信号传导与PD相比较呈现减弱的趋势[16-17]。已有研究显示[18-19]，LID时大鼠脑内CB1受体的表达发生了改变，主要表现损毁侧纹状体内CB1受体的表达较PD相比较呈降低趋势。本实验研究亦发现阴虚动风证LID模型大鼠在纹状体内大麻素CB1受体的表达呈现上调趋势，但随着造模时间的延长，其纹状体内大麻素CB1受体表达呈现下调趋势。这与文献研究[20]结果一致。L-dopa由于其半衰期较短，其波动性也较大，这种非生理性的波动性刺激，随着治疗时间的延长可能会引起中型多棘神经元所介导信号通路的改变，并直接影响到直接和间接通路，导致纹状体内谷氨酸系统过度活化[21]，引起大麻素CB1受体代偿性增多。

本研究在前期研究的基础上，应用治疗PD及LID的有效方——复方地黄方进行干预研究，复方地黄方中熟地黄补肾益精，滋阴养血，固本培元为君药。白芍养肝血，滋肝阴，柔肝气，为养血濡筋，缓急止颤之良药；钩藤熄风定惊，化痰舒筋。白芍与钩藤等同用，共为臣药，可助君药滋阴养血、熄风平肝。丹参养血、活血、化瘀。石菖蒲能提高血脑屏障通透性，起到醒脑开窍、引药入脑的作用。全方共奏滋补肝肾，平肝熄风、化痰祛瘀、解毒散结之功效[22]。我们的研究发现，复方地黄方组大鼠纹状体内CB1受体的表达较LID模型组呈升高趋势，并且随着复方地黄方干预时间的延长，大鼠纹状体内CB1受体升高趋势更明显。我们推测复方地黄方可能通过激活纹状体内大麻素CB1受体，使CB1受体的表达升高，进而抑制兴奋性氨基酸(主要是谷氨酸)的释放，从而减轻了兴奋性毒性的结果[23]。复方地黄方也可能是通过增加纹状体内大麻素CB1系统的信号传导来调节直接通路和间接通路失衡的状态，起到内源性保护的作用。

总之，阴虚动风证LID时，模型大鼠处于L-dopa反复波动性刺激DA受体的过程中，可导致皮质纹状体Glu受体磷酸化，Glu投射超敏，兴奋性毒性增加，大麻素CB1受体的信号传导相对减弱，共同促使运动并发症的发生，使得模型大鼠产生神经行为学表现。以滋阴熄风为主的中药复方地黄方对阴虚动风证帕金森病LID模型大鼠能够明显缓解其的动风特征，能明显清除自由基和降低兴奋性毒性，从而起到“减毒增效”的作用。

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Effects of compound rehmannia prescription on the cannabinoid receptor 1 in rats with wind syndrome due to deficiency of Yin in levodopa-induced dyskinesia (LID) in Parkinson’s disease

TENG Long1，2, HONG Fang1, HE Jian-cheng1

(1.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;2.Zhejiang Hospital, Hanzhou 310013, China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of compound rehmannia prescription on cannabinoid receptor 1 in the rats with wind syndrome due to deficiency of Yin in levodopa-induced dyskinesia (LID) in Parkinson’s disease. Method A unilateral injection of 6-hydroxydopamine into the substantia nigra was performed to establish a Sprague-Dawley rat model of Parkinson’s disease. The models were intraperitoneally injected with 50 mg/kg levodopa and 12.5 mg/kg benserazide for two weeks to prepare LID models with Wind syndrome due to deficiency of Yin. The models were randomly divided into LID group and compound rehmannia prescription groups. Moreover, the normal group and sham-operated group were set up, 6 rats in each group. Neurological behavior was tested after treatment for four weeks and six weeks, respectively. Then the rats were sacrificed, the brain was removed immediately and the corpus striatum was dissected out. The expression of cannabinoid receptor 1 was examined by Western blotting. ResultWith the prolonged time of levodopa treatment, the LID rats with wind syndrome due to deficiency of yin showed an increasing tendency of AIM scores (P<0.05), shortening of the rotation start time (P>0.05), a tendency of increased duration of continuous rotation time (P<0.01) and a reducing tendency of peak rotation rate (P>0.05). Compound rehmannia prescription improved the above mentioned neurological behavior. The expression of cannabinoid receptor 1 showed an increasing tendency in the LID groups compared with that in the normal groups. But with the prolonging time of levodopa treatment, the expression of cannabinoid receptor 1 in the LID groups showed a decreasing tendency (P<0.01). The expression of cannabinoid receptor 1 had an increasing tendency after the treatment with compound rehmannia prescription (P<0.01). Conclusions The expression of cannabinoid receptor 1 has an increasing tendency in LID rats with wind syndrome due to deficiency of yin. The changes can well reflect the severity of wind syndrome due to deficiency of yin. We would hypothesize that the treatment with compound rehmannia prescription may activate the cannabinoid receptor 1 in LID rats, inhibiting the release of excitatory amino acids, decreasing the excitability of neurons and inducing cell cascade, and finally reduce the excitatory toxicity of levodopa.

【Key words】Parkinson’s Disease; Levodopa-induced dyskinesia；Wind syndrome due to deficiency of yin; Cannabinoid receptor 1; Compound rehmannia prescription

[收稿日期]2015-09-16

Corresponding author:HE Jian-cheng, E-mail： hjc8163@163.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.006

【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847(2016) 01-0031-06

[作者简介]滕龙(1985-)，男，医学硕士，主要从事中医证候研究。[通讯作者]何建成(1966-)，男，教授，博士生导师，从事中医四诊、证候及心脑血管疾病的基础与临床研究。E-mail： hjc8163@163.com。

[基金项目]国家自然科学基金(30973722)；上海市科技支撑中药新药研究与开发项目(F50102)；上海市卫生局中医药科研基金(2012J009A)；上海市卫生计生委科研基金(20144Y0151)；浙江省中医药优秀青年人才基金项目(2016ZQ005)；上海中医药大学预算内科研项目(2013JW25)。