益生菌对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜Toll样受体表达的影响及其意义

刘　超　朱耀明

(三峡大学第一临床医学院　宜昌市中心人民医院胃肠外科,湖北　宜昌　443000)



益生菌对溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜Toll样受体表达的影响及其意义

刘超朱耀明

(三峡大学第一临床医学院宜昌市中心人民医院胃肠外科,湖北宜昌443000)

〔摘要〕目的探讨益生菌对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎模型大鼠肠黏膜Toll样受体(TLR)的影响及其临床意义。方法40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、益生菌组和美沙拉嗪组。对照组正常饲养，不予任何处理；模型组、益生菌组和美沙拉嗪组给予含5%葡聚糖硫酸钠饮用水10 d建立溃疡性结肠炎模型，益生菌组和美沙拉嗪组于第11天分别给予酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪灌胃治疗14 d。14 d后处死所有大鼠，观察疾病活动指数，进行组织学评分，RT-PCR法检测TLR2和TLR4的表达，免疫组化方法检测转转录因子(NF)-κB的活性。结果模型组的疾病活动指数和组织学评分显著高于对照组，益生菌组和美沙拉嗪组低于模型组(P<0.05)。模型组TLR2和TLR4的表达显著高于对照组，益生菌组和美沙拉嗪组高于对照组且低于模型组(P<0.05)，而益生菌组和美沙拉嗪组间差异不显著(P>0.05)。模型组NF-κB的活性显著高于对照组，益生菌组和美沙拉嗪组高于对照组且低于模型组(P<0.05)，而益生菌组和美沙拉嗪组间差异不显著(P>0.05)。结论溃疡性结肠炎模型大鼠中TLR表达异常，NF-κB的活性增加，益生菌及美沙拉嗪制剂可降低溃疡性结肠炎模型大鼠TLR表达和NF-κB的活性，是治疗溃疡性结肠炎的有效方法。

〔关键词〕溃疡性结肠炎；Toll样受体；益生菌；酪酸梭菌活菌葡聚糖硫酸钠片；葡聚糖硫酸钠

目前，溃疡性结肠炎发病机制尚未完全阐明〔1〕。Toll样受体(TLR)是先天性免疫重要的跨膜受体和模式识别受体，能够识别病原体相关分子模式，阻断通路中各转导节点，减弱溃疡性结肠炎的炎症反应，有助于治疗的评定治疗作用〔2〕。益生菌是一类微生态制剂，研究表明益生菌对溃疡性结肠炎具有缓解作用，但其作用机制尚不明确〔3〕。本研究旨在探究益生菌治疗溃疡性结肠炎的机制。

1资料与方法

1.1实验动物及材料40只SD大鼠购于北京维通利华实验动物中心(合格证号：SCXK(京)DBQ800)，体重230～270 g，均为雄性。引物由上海生土生物土程有限公司设计，RT-PCR试剂盒购于Fermentas公司，酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于BD公司，Marker购于天根生化科技有限公司。葡聚糖硫酸钠购于Sigma公司，酪酸梭菌活菌片(青岛东海药业有限公司)，美沙拉嗪胶囊(葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司)，其他试剂为国产。

1.2动物模型制备及处理40只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、益生菌组和美沙拉嗪组，每组10只。对照组正常饲养，不给予任何干预，其他三组大鼠在动物房饲养1 w后，给予含5%葡聚糖硫酸钠饮用水10 d建立溃疡性结肠炎模型，益生菌组和美沙拉嗪组于第11天分别给予酪酸梭菌活菌(700 mg·kg-1·d-1，1次/d)和美沙拉嗪(500 mg·kg-1·d-1，1次/d)灌胃给药治疗14 d，模型组等容量生理盐水灌胃，称取大鼠体重，观察大便形态和便血情况。治疗14 d后处死所有大鼠，切开结肠管，观察黏膜损伤情况，分别取远中近段组织标本进行免疫组化染色观察及检测核转录因子(NF)-κB活性，组织样本保存在液氮罐中10 min,取出放于-80℃备用。

1.3肠上皮细胞提取将肠道组织翻转内膜向外，用D-Hanks溶液冲洗以去除黏膜的粪便，将肠组织置于含5.0 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.145 mg/ml二硫苏糖醇(DTT)的D-Hank溶液中37℃摇床 90 min，3 000 r/min离心10 min，沉淀为肠上皮细胞。

1.4检测方法RT-PCR法：结肠组织按Trizol法提取RNA，在260/280 nm处检测RNA的浓度，进行反转录，具体步骤参照RT试剂盒说明。PCR扩增引物序列，TLR2 上游：ttgctcctgcgaactcctat，下游：gctttcttgggcttcctctt；TLR4 上游：gctttcacctctgccttcac，下游：cgaggcttttccatccaata；β-actin上游：accacagtccatgccatcac，下游：tccaccaccctgttgctgta。反应条件：94℃ 40 s，59℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环。取PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳，目标mRNA的表达使用内参β-actin进行校正。免疫组织化学方法应用标准的三步法进行检测，一抗为NF-κB p65亚基的单克隆抗体，二抗为山羊抗鼠IgG抗体，NF-κB活化评分在400倍高倍显微镜进行，每个视野中NF-κB阳性细胞百分比0%～1%为0分，2%～5%为1分，6%～10%为2分，11%～25%为3分〔4〕。

1.5疾病活动指数和组织学评分疾病活动指数，①体重下降：体重不变0分、下降1%～5%1分、下降5%～10%2分、下降10%～15%3分、下降>15%4分。②大便形态：0分为正常、2分为松散、3分为腹泻。③便血：0分为正常、2分为隐性出血、4分为显性出血。疾病活动指数=(体重指数+大便形状+出血情况)/3。

组织学评分：针对处理免疫组化结果评分方法，将各组切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的，使用Σpi(i+1)表示，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度。

1.6统计学方法采用SPSS19.0软件进行t检验和χ2检验。

2结果

2.1各模型组疾病活动指数和组织学评分比较模型组、益生菌组、美沙拉嗪组给予含5%葡聚糖硫酸钠饮用水7～8 d出现腹泻、便血、进食量明显减少、体质量下降等。益生菌组、美沙拉嗪组进过灌胃治疗后腹泻、便血症状明显好转，模型组症状持续无减轻，体质量下降，对照组则无上述典型症状出现，体质量逐渐增加。模型组、益生菌组和美沙拉嗪组的疾病活动指数(8.92±1.13，3.67±0.75，4.03±0.84)及组织学评分(12.13±0.94，5.53±0.68，5.82±0.79)显著高于对照组(0.15±0.11，0.21±0.09)，其中益生菌组和美沙拉嗪组均低于模型组(P<0.05)，而益生菌组和美沙拉嗪组间差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2组织病理学变化对照组肠腺体排列整齐，腺体间有较多杯状细胞，固有层少量淋巴细胞浸润。模型组肠黏膜下炎性细胞浸润，结构紊乱，隐窝脓肿形成，溃疡边缘腺体增生较重，杯状细胞减少，下层出血水肿。益生菌组、美沙拉嗪组黏膜下层炎性细胞浸润减少，黏膜充血水肿明显减轻。见图1。

对照组

模型组

益生菌组

美沙拉嗪组

2.3肠上皮细胞TLR2和TLR4的表达模型组、益生菌组和美沙拉嗪组的TLR2(0.92±0.13，0.67±0.09，0.64±0.10)和TLR4(1.13±0.14，0.53±0.09，0.52±0.09)的表达水平均显著高于对照组(0.25±0.08，0.31±0.08)，其中益生菌组和美沙拉嗪组均低于模型组(P<0.05)，而益生菌组和美沙拉嗪组间差异不显著(P>0.05)。

2.4NF-κB免疫组织化学结果模型组、益生菌组和美沙拉嗪组的NF-κB的活性分别为(2.43±0.54)、(0.85±0.31)、(0.82±0.29)，均显著高于对照组的(0.41±0.28)，其中益生菌组和美沙拉嗪组均低于模型组(P<0.05)，而益生菌组和美沙拉嗪组间差异不显著(P>0.05)。

3讨论

多数学者认为溃疡性结肠炎的发病主要与遗传易感性、肠道菌群紊乱、肠黏膜免疫异常、感染等因素有关〔5〕。随着对肠道微生态学及免疫学的发展，证实肠道菌群的紊乱与溃疡性结肠炎的发病存在一定的相关性。研究显示〔6〕，与缓解期溃疡性结肠炎患者相比，急性期肠道有益菌明显减少，而中间菌及有害菌大量增多，肠道菌群紊乱，炎症持续存在。益生菌具有抑制肠道有害菌生长、毒素释放，增大肠道蠕动频率，促进消化，改善肠道机能，且其通过刺激肠道内的免疫功能，将过低或过高的免疫活性调节至正常状态，有助于增强人体免疫力，对溃疡性结肠炎具有缓解及改善预后的作用。

TLR是天然免疫系统识别微生物的蛋白，在防御机制中具有重要作用，表达于天然免疫细胞和特异性免疫细胞，TLR介导的信号传导可导致固有免疫细胞活化，分泌促炎症细胞因子，诱导炎症发生，同时可诱导并刺激分子表达，启动特异性免疫应答产生〔7〕。TLR能够通过识别病原相关分子，最终激活NF-κB和丝裂原蛋白激酶，加重溃疡性结肠炎炎症发展〔8〕。本研究说明酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎疗效显著，可显著缓解患者的肠道炎症，调节肠道菌群平衡，恢复便状。分析原因：酪酸梭菌活菌能耐受胃酸进入肠道，分泌肠黏膜再生和修复所需的重要营养物质酪酸(丁酸)，并能促进有益菌生长，抑制肠道有害菌生长，恢复肠道菌群平衡〔9〕；抑制抗结肠抗体IgG的过度表达，降低B淋巴细胞转化率，提高T淋巴细胞转化率，纠正肠免疫紊乱，恢复肠免疫耐受力。美沙拉嗪是治疗溃疡性结肠炎的活性成分，对肠壁的炎症也有显著的抑制作用〔10〕。

本研究进一步提示溃疡性结肠炎的发生与发展可能与TLR、NF-κB的表达有关，而酪酸梭菌活菌和美沙拉嗪可通过调节TLR、NF-κB的表达水平来改善患者症状。本研究说明益生菌和美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎效果相当。

4参考文献

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4Bantel H,Berg C,Vieth M,etal.Mesalazine inhibits activation of transcription factor NF-κB in inflamed mucosa of patients with ulcerative colitis〔J〕.Am J Gastroenterol,2000;95(12):3452-7.

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10谭芳,高鸿亮,杨涛,等.益生菌对急性溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜Toll样受体表达的影响〔J〕.中国微生态学杂志,2015;27(7):749-52.

〔2015-07-25修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

〔中图分类号〕R574.62

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)06-1304-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.011

通讯作者：朱耀明(1952-)，男，主任医师，主要从事胃肠外科方面的研究。

第一作者：刘超(1982-)，男，硕士，主治医师，主要从事胃肠外科方面的研究。