谷胱甘肽保护的金纳米团簇对HeLa细胞毒性研究

王骏滢 薛虚慧 张晓东 孙元明

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院放射医学研究所；天津市放射医学与分子核医学重点实验室

谷胱甘肽保护的金纳米团簇对HeLa细胞毒性研究

王骏滢 薛虚慧 张晓东 孙元明

300192天津，中国医学科学院 北京协和医学院放射医学研究所；天津市放射医学与分子核医学重点实验室

目的 探究由谷胱甘肽作为表面保护剂的金纳米团簇（GSH-Au NCs）对宫颈癌HeLa细胞株的毒性影响。方法 利用荧光分光光度计测定用含有GSH-Au NCs的培养基处理HeLa细胞后不同时间点的荧光强度，观察HeLa细胞对GSH-Au NCs在1、2、6、12、24 h内的摄取情况。同时采用BALB/c荷瘤小鼠进行体内实验，分别腹腔注射0.2 ml浓度为3 mmol/L的GSH-Au NCs和等体积的蒸馏水（对照组）后24 h取出肿瘤组织，通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测组织中的金元素含量以探究纳米团簇在肿瘤处随时间的摄取情况。最后用噻唑蓝（MTT）比色法研究不同浓度（0.003～0.3 mmol/L）的GSH-Au NCs处理HeLa细胞24、48 h的细胞毒性。结果 HeLa细胞对GSH-Au NCs的摄取率在24 h内不断升高，24 h时达峰值73.13%。荷瘤小鼠实验表明，腹腔注射GSH-Au NCs 24 h后，肿瘤组织对GSH-Au NCs的摄取量（320±15）ng/g较对照组（腹腔注射蒸馏水）高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。用不同浓度的GSH-Au NCs处理HeLa细胞24 h，对细胞存活率有轻微影响，随浓度升高对细胞的抑制作用更为明显，GSH-Au NCs浓度为0.3 mmol/L时的HeLa细胞存活率降为对照组（GSH-Au NCs浓度为0）的86%（P＜0.05）；处理48 h时，各浓度组的细胞存活率与对照组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 虽然 GSH-Au NCs在体外和体内均易被细胞和肿瘤组织摄取，但其本身对HeLa细胞并无明显细胞毒性，可安全应用于影像、载药及靶向给药等生物医药领域。

谷胱甘肽保护的金纳米团簇； 细胞毒性； HeLa细胞

0 引言

金纳米团簇（Au nanoclusters,Au NCs）是一类尺寸易调控、水溶性好的无机小分子纳米材料，表面易修饰载药，具有良好的荧光特性，能实现高效肾清除[1-3],近年来在肿瘤相关的生物成像、放射增敏等领域得到了广泛关注。肿瘤组织对谷光甘肽保护的金纳米团簇（glutathione protected Au nanoclusters, GSH-Au NCs）的摄取能力主要取决于后者的尺寸与结构，亲水半径＜5 nm的GSH-Au NCs能大部分（90%以上）通过肾脏排出。此外，尺寸较小的纳米团簇对肿瘤的靶向作用更好，这是由于肿瘤组织内血管基质不完善且血管系统丰富，血管内皮细胞间隙较正常组织更宽，使得小分子纳米团簇被动进入肿瘤；同时肿瘤组织内淋巴回流缺陷，使得进入的GSH-Au NCs不易被排出，称为增强渗透和滞留效应（enhanced permeability and retention,EPR）[4]。通常GSH-Au NCs进入生物内环境后，会与血浆中的多种蛋白相互作用并吸附至其表面，在调理作用下被巨噬细胞识别捕获；同时粒径增大也使得GSH-Au NCs更易进入肝脾网状内皮系统，长期积累易产生病灶。因此，对GSH-Au NCs表面进行修饰能有效延长其血液循环时间从而持续在肿瘤组织积累。GSH是广泛存在于生物体内的小分子多肽，对机体免疫和解毒有积极作用。将GSH-Au NCs通过Au—S共价键结合，包埋于GSH内能有效帮助其减少蛋白吸附并躲避肝脾摄取，同时暴露于表面的羧基与氨基使得GSH-Au NCs便于修饰载药。基于上述特点，GSH-Au NCs是纳米材料中最具优势的放射增敏剂和载药材料之一。研究表明，GSH-Au10在肿瘤部位24 h的累积量是聚乙二醇（PEG）-Au纳米颗粒及肝、肾等主要靶器官的10倍之多[5-6]，能显著抑制肿瘤体积（67%）和质量，同时具有很高的生物安全性。本研究旨在探讨HeLa细胞对GSH-Au NCs的摄取能力以及可能带来的细胞毒性。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

GSH、HAuCl4·3H2O、噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide,MTT）、Na2EDTA、Tris-HCI、曲拉通X-100（Triton X-100）、溴化乙锭（美国Sigma公司），NaOH、NaCl（天津江天化工技术有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）（美国Gibco公司），DMEM培养基（美国Hyclone公司），3 ku超滤管（美国Millipore公司），HeLa细胞（中国医学科学院放射医学研究所储存）。健康SPF级BALB/c裸鼠8只（雄性6～8周，体质量16～18 g）（北京维通利华实验动物技术有限公司）。

F4500荧光分光光度计（日本日立公司），紫外分光光度计（日本岛津公司），JEM-2100F透射电镜、7500ce电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）（美国安捷伦公司），Tecan-200酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.2 方法

1.2.1 GSH-Au NCs的合成与表征

根据已报道的合成方法[7]，将0.15 ml浓度为100 mmol/L GSH与 0.5 ml浓度为 20 mmol/L的HAuCl4·3H2O混于5 ml超纯水中25℃搅拌，随后将温度上升到70℃搅拌过夜，得到的浅黄色溶液即为产物。再用3 ku超滤管除去未反应完全的小分子杂质。采用透射电镜观察合成的GSH-Au NCs的大小及形态，利用紫外和荧光分光光度计鉴定特征峰。

1.2.2 细胞及体内摄取实验

将 HeLa细胞用含体积分数为10%FBS的DMEM培养基培养于饱和湿度、5%CO2、37℃培养箱中。取对数期生长的细胞，按每孔5×105个HeLa细胞接种于6孔板中，设无细胞的空白对照组和实验组，每组设3个复孔；24 h后更换为含3 mmol/L GSH-Au NCs的培养基1 ml，37℃培养箱中孵育不同时间（0、1、2、6、12、24 h），分别收集各时间点的培养基，以365 nm为激发波长，测定610 nm处的荧光强度。用空白对照组培养基的荧光强度值减去实验组各时间点培养基的荧光强度值即为细胞所摄取的GSH-Au NCs量。

将1.4×107个HeLa细胞接种于BALB/c雄性裸鼠左侧腋下，待肿瘤生长约为10 mg/kg体质量时用于实验。荷瘤小鼠分为给药组（GSH-Au NCs处理）和对照组（蒸馏水处理），每组3只。两组小鼠分别腹腔注射0.2 ml浓度为3 mmol/L的GSH-Au NCs水溶液和等体积的蒸馏水，24 h后脱颈处死后取出肿瘤组织称质量，微波消解后利用ICP-MS检测金（Au）元素含量。

1.2.3 细胞毒实验

将HeLa细胞种于96孔板内，每孔6×103个细胞，每组5个复孔；培养24 h后对照组更换新鲜培养基，给药组则更换含不同浓度（0.003、0.01、0.03、0.1、0.3 mmol/L）GSH-Au NCs的培养基，每孔总体积均为100 μl；给药24、48 h后加入10 μl MTT，孵育4 h后弃去培养基，加入二甲基亚砜溶解结晶，摇床晃动15 min后用酶标仪检测490 nm处的吸光度值并计算细胞存活率。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（x±s）表示，对GSH-Au NCs的细胞摄取率和存活率进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 GSH-Au NCs的表征

图1A、1B分别为GSH-Au NCs在200～450 nm的紫外吸收光谱图和在450～800 nm的荧光光谱图。从图1A可看出，GSH-Au NCs在390 nm处呈特征吸收肩峰。同时，当以365 nm为激发波长时，可发现GSH-Au NCs的发射峰位于610 nm附近，与文献报道相一致[8]。透射电镜结果显示，GSH-Au NCs的大小分布比较均匀，平均粒径约为3 nm（图1C），这与之前的研究结果一致[8-9]。使用化学还原法，可合成出不同尺寸的GSH-Au NCs，但不同尺寸纳米团簇的光学性质差异很大[10-14]。如由10～12个Au原子构成的Au10-12纳米团簇吸收峰约在365 nm，但无任何荧光[9]；Au25纳米团簇的吸收峰约位于650 nm，荧光发射峰位于670 nm；而Au29-37纳米团簇的吸收峰位于390 nm，荧光发射峰位于610 nm。因此，通过紫外和荧光光谱研究，可确定本研究中的合成产物为GSH-Au29-37纳米团簇。由于GSH是一种小肽分子，不仅具有小的分子质量，还具有良好的生物相容性，为此，笔者将进一步研究GSH-Au NCs的细胞摄取和毒性。

2.2 细胞及体内肿瘤摄取实验

图2显示了时间对HeLa细胞摄取GSH-Au NCs的影响。从图中可以看到，当摄取1 h时，GSHAu NCs的细胞摄取率为（8.13±2.40）%；摄取2 h时，细胞摄取率为（10.34±2.89）%；随着摄取时间增加到6、12、24 h，相应的细胞摄取率分别为（43.56± 4.28）%、（54.57±4.05）%、（73.13±3.20）%，分别与1、2 h时比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），且6、12、24 h的细胞摄取率两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。以上表明在24 h内细胞摄取率逐渐升高，24 h时达最高值（73.13%）。笔者进一步研究了体内肿瘤摄取情况。图3呈现了给药24 h后，小鼠HeLa肿瘤组织对GSH-Au NCs的摄取。从图中可以看出，对照组（腹腔注射蒸馏水）小鼠体内的Au含量为（7.8±3.0）ng/g，几乎可以忽略。Au为重金属，在正常生物体内的含量可以忽略。然而，在GSH-Au NCs处理24 h后，肿瘤组织摄取的Au含量为（320±15）ng/g，即（1.34±0.20）%ID/g（%ID/g指每克组织中Au元素的百分含量）。纳米材料在肿瘤组织中的摄取，既与纳米颗粒的形状相关，又与纳米颗粒的尺寸相关。笔者前期研究发现尺寸越小，其EPR效应越明显，在肿瘤组织中的摄取就越高[15]。同时，发现GSH配体具有较好的生物相容性，可最大程度地保护纳米团簇免受生物环境的破坏，有效防止内皮网状细胞的吞噬，具有较好的血液稳定性和体内稳定性[16]。笔者所在课题组最新研究的几类GSH保护的纳米团簇也表现出高稳定性、高效肾清除、高肿瘤特异性及低毒等特性[8-9,17]，这与本研究的结果一致。9.67）%；当浓度增加至0.3 mmol/L时，24 h时的细胞存活率为（86.00±10.65）%。可见不同浓度的GSH-Au NCs与HeLa细胞作用24 h后，对HeLa细胞的存活率会有轻微影响，随着浓度的升高细胞存活率逐渐降低，抑制作用更为明显，GSH-Au CNs浓度为0.3 mmol/L时的HeLa细胞存活率降为对照组（GSH-Au CNs浓度为0）的86%（P＜0.05）。当用GSH-Au CNs处理HeLa细胞48 h时，各浓度组的细胞存活率与对照组间差异均无统计学意义（P＞0.05），表明GSH-Au NCs进入细胞后不会产生长期或严重的不良影响。已有研究报道GSH是一种良好的表面活性剂，可通过独特的共价结构和GSH-Au NCs结合，形成稳定的纳米团簇[1]。因此GSH-Au NCs具有较低的细胞毒性。结合细胞和动物体内摄取实验的结果，GSH-Au NCs有望作为一种新型的功能材料广泛应用于生物医学领域，特别是肿瘤治疗和成像等方面。

图1 谷光甘肽保护的超小金纳米团簇的表征

图2 时间对HeLa细胞摄取GSH-Au NCs的影响

图3 荷瘤小鼠腹腔注射蒸馏水与GSH-Au NCs 24 h后肿瘤组织摄取的金元素含量

图4 不同浓度的GSH-Au NCs与HeLa细胞作用24、48 h后的细胞存活率

3 结论

本研究采用化学还原法合成了GSH-Au NCs，通过透射电子显微镜观察发现，纳米团簇的尺寸约为3 nm，其发光峰位于610 nm。细胞摄取实验表明，HeLa细胞对GSH-Au NCs具有较高的摄取，且细胞摄取率随摄取时间的延长而提高。体内实验表明，GSH-Au NCs在给药24 h后，具有较高的肿瘤摄取。细胞毒实验结果发现，GSH-Au NCs对HeLa细胞活性影响较小。GSH-Au NCs处理HeLa细胞24、48 h后，其细胞毒性较低。总之，GSH-Au NCs具有小尺寸、低毒和肿瘤摄取高效的特性，有望用于肿瘤治疗和成像等领域。

利益冲突 无

2.3 细胞毒性

图4表明了不同浓度的GSH-Au NCs对HeLa的细胞毒性。用MTT法研究了0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3 mmol/L浓度下的GSH-Au NCs对HeLa细胞的毒性。从图4可看出，0.003 mmol/L GSH-Au NCs处理HeLa细胞24 h时的细胞存活率为（94.00±

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Study of glutathione protected gold nanoclusters on HeLa cytotoxicity

Wang Junying,Xue Xuhui,Zhang Xiaodong,Sun Yuanming
Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College;Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Tianjin 300192,China Corresponding author:Sun Yuanming,Email:sunyuanming@irm-cams.ac.cn

Objective To investigate the effects of glutathione protected gold nanoclusters(GSH-Au NCs) on HeLa cytotoxity.Methods Fluorescence intensity were measured on GSH-Au NCs containing medium treated cells using fluorescence spectrophotometer at different time points.GSH-Au NCs uptake by HeLa cells at 1,2,6,12 and 24 h were investigated through fluorescent spectrophotometer.In vivo tumor uptake was also investigated on BALB/c tumor-bearing mice through inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS)at 24 h after intraperitoneal injection of 0.2 ml GSH-Au NCs(3 mmol/L)and distilled water(control group)respectively.The cytotoxicity of GSH-Au NCs at different doses(0.003-0.3 mmol/L)was tested at 24 and 48 h using MTT assay after interaction with HeLa cells.Results The uptake efficiency of GSH-Au NCs by HeLa cells kept increasing and reached maximum of 73.13%at 24 h.The results of tumor-bearing mice indicated that the tumor tissue had higher uptake efficiency after 24 h(320±15)ng/g than that of control group(intraperitoneal injection of distilled water),and the difference was stastically significant(P＜0.05).HeLa cells were treated with different concentrations of GSH-Au NCs for 24 h,and GSHAu NCs had a slight effect on cell viability.With the increase of GSH-Au NCs dose,the inhibition effects on growth of HeLa cells enhanced.The cell activity of HeLa cells treated with 0.3 mmol/L GSH-Au NCs for 24 h reduced to 86% compared with that of control group(the concentration of GSH-Au NCs was 0)(P＜0.05),while there was no significant difference between the survival rate of different concentrations of GSH-Au NCs group and the control group for 48 h. Conclusions GSH-Au NCs have neglectable cytotoxity on HeLa cells even though both in vitro and in vivo uptakeare high.GSH-Au NCs are suitable for biomedical application such as imaging,drug loading and targeted drug delivery.

Glutathione protected gold nanoclusters; Cytotoxicity; HeLa cells

NationalNaturalScienceFoundationofChina(81471786);NaturalScienceFoundationofTianjin (14JCYBJC26700,13JCQNJC13500);Institute of Radiation Medicine&Chinese Academy of Medical Sciences Research Fund(1558)

孙元明，Email:sunyuanming@irm-cams.ac.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．02．005

国家自然科学基金（81471786）；天津市自然科学基金（14JCYBJC26700，13JCQNJC13500）；中国医学科学院放射医学研究所发展基金（所探1558）

2016-01-06）