代谢组学技术在环境毒理学研究中的应用
2016-04-10耿柠波张海军王菲迪任晓倩张保琴陈吉平
耿柠波，张海军,#，王菲迪,2，任晓倩,2，张保琴，陈吉平,*
1.中国科学院大连化学物理研究所分离分析化学重点实验室，大连116023
2.中国科学院大学，北京100049
代谢组学技术在环境毒理学研究中的应用
耿柠波1，张海军1,#，王菲迪1,2，任晓倩1,2，张保琴1，陈吉平1,*
1.中国科学院大连化学物理研究所分离分析化学重点实验室，大连116023
2.中国科学院大学，北京100049
代谢组学作为系统生物学的一部分，通过考察机体受刺激后体液或组织中内源性代谢物的动态变化规律，并结合生物信息统计方法，可系统全面地揭示内因和外因作用于机体的毒性效应和机制。代谢组学技术具有快速、灵敏度高、选择性强的特点，逐渐在低剂量环境污染物长期暴露的毒性效应评估方面发挥出优势。本文综述了代谢组学技术的主要研究手段，在毒理学研究中的发展历程和优点，以及在环境毒理学研究中的应用及前景展望。重点讨论了代谢组学技术在重金属和持久性有机污染物(POPs)毒性评估以及环境胁迫耐受性评价中的应用。
代谢组学；环境毒理学；NMR；LC/GC-MS；环境胁迫
耿柠波,张海军,王菲迪,等.代谢组学技术在环境毒理学研究中的应用[J].生态毒理学报，2016,11(3):26-35
Geng N B,Zhang H J,Wang F D,et al.A review on the application of metabonomic approaches in environmental toxicology[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2016,11(3):26-35(in Chinese)
环境毒理学是利用毒理学方法，研究环境污染物对人体健康的影响及其机理的学科，是毒理学的一个重要分支。其主要任务是研究环境污染物对机体可能产生的生物效应，作用机理及早期损害的检测指标。环境污染物对机体的作用一般具有接触剂量较小；长时间内反复接触甚至终生接触；多种环境污染物同时作用于机体；接触的人群易感性差异大等特点，因此外源化合物的低水平长期慢性接触，将是新世纪中各种环境污染物对人体影响的基本方式[1]。传统的毒性测试具有通量低、周期长、敏感度低和资源耗费等特点，显然不能满足对这些环境污染物进行毒性测试的需求。近年来，随着毒理学新技术的发展，在毒物的安全性评价方法上，国外发达国家已经逐步实现了从传统的整体动物试验到快速、灵敏、高效的替代试验的转变。美国科学院发布的一个报告“21世纪毒理学测试新方法”指出应将新的毒理学评价方法纳入未来的毒性测试系统中去，用毒性通路的理念从系统生物学方向来阐述毒物的毒性作用[2]。基因组学，蛋白组学和代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，其高通量筛选特征使其在毒物的毒性作用效应和机制研究上具备很大的优势[3]。
代谢组学是研究生物体内源性代谢物的整体及其随内因和外因变化的科学。代谢物的变化可灵敏地指示和确证外来干扰物在组织和器官水平的毒性效应，某种特定代谢物的蓄积可能标志着某通路的缺陷或某信号响应的激活，而代谢物的动态变化可以作为毒性损伤的标志物，因此将其用于污染物的毒性评价在技术上是可行的[4]。代谢组学之所以能在毒理学研究中发挥巨大作用，是基于反映毒性作用的信息能够在生物体的代谢过程中全面地表现出来。当毒物与细胞或者组织相互作用时，会引起生物体内关键代谢过程中内源性物质比例、浓度的变化并通过体液组成的变化反映出来。生物体液的谱图中所检测到的是成百上千种指示不同代谢路径的化合物，这些代谢层面的生物信息能够很好地表征环境因素的毒性通路和毒性作用机制。代谢组学技术为生物标志物的发现提供了新的思路和平台，在毒性作用机制研究上具有很大的优势，其全景式高通量筛选特征必将为生物化学测量提供综合视角，在21世纪毒理学测试中发挥重要作用。
1 代谢组学的主要研究手段和在毒理学研究中的优势
1.1 代谢组学研究的基本方法
代谢组学是继基因组学和蛋白组学新发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。Fiehn等[5]按照研究目的不同将代谢组学分为4类：代谢物靶标分析(Metabolite Target Analysis)，代谢物轮廓分析(Metabolite Profiling Analysis)，代谢指纹分析(Metabolite Fingerprinting Analysis)和代谢组学(Metabonomics)分析，在后来的研究中又引申出了生物标志物分析(Biomarker Analysis)[6]。先进的分析检测技术结合化学计量学计算分析方法是代谢组学研究依靠的基本方法。
代谢组学研究依赖于各种高通量的技术平台，常用的有核磁共振(NMR)、质谱(LC-MS/GC-MS)、生物芯片等。20世纪70年代，代谢组学分析通常采用核磁共振技术。尽管NMR技术存在灵敏度较低，检测成本较高等不足，但由于其具有可深入物质内部而不破坏样品的特征和迅速、准确、分辨率高的优点，在最初的代谢组学研究中得到了应用。与NMR相比，LC-MS/MS对样本制备要求不高，且具有灵敏度高、动态范围宽、可以检测样本中浓度相差较大的代谢物等特点，而且将广泛适用、分离能力强的LC和灵敏度高、准确性好的MS结合，即可以定量又可以定性，成为代谢组学研究中应用越来越多的技术平台。作为一项成熟的分析技术，GC-MS的分析灵敏度高，非常适合于挥发性物质的代谢组学研究，而且GC-MS的最大优势在于化合物结构鉴定可比对标准谱库。对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质可通过硅烷化、甲基化和酰基化等衍生化方法改善其挥发性、峰形、分离度以及灵敏度，在代谢组学研究中被广泛应用。
1.2 代谢组学在毒理学研究中的发展历程
代谢组学最初是由英国帝国理工大学的Jeremy Nicholson教授提出的，到目前为止，代谢组学在毒理学研究中应用最广泛的是用于药物毒性效应评价[7-8]。由于代谢组学研究方法可以无损地监测机体生理状态，动态评价药物毒性效应，在药物毒性效应评估中发挥了巨大作用。该领域影响最大的工作是由Nicholson团队所领导的COMET(Consortium for Metabonomic Toxicology)项目[9]，该项目由英国帝国理工学院和5家制药公司共同完成，用80种已知毒性药物暴露后大鼠尿液的1H-NMR谱，构建了肝毒性、肾毒性和其他毒性预测分类的专家系统(A Modeling System for Toxicity Prediction)。并用该系统对近70种药物的肝或肾毒性进行预测，结果表明该系统对肝、肾毒性的预测敏感性分别为67%和41%，而对肝、肾毒性的特异性则分别为77%和100%。总体而言，该项目建立了一个预测临床前候选药物肝、肾毒性的专家系统，能够在药物毒性快速筛选中发挥功效。
其他研究人员也应用代谢组学技术在药物毒性评估方面做了一系列相关研究。West等(2010)[10]以胚胎干细胞为模式细胞，对致畸和非致畸类的18种化合物进行代谢组学评价，结果表明致畸类化合物干扰了尿素循环中精氨酸，天冬氨酸和二甲基精氨酸水平，以及三羧酸循环中苹果酸、琥珀酸和异亮氨酸的含量。精氨酸与二甲基精氨酸倍率变化的比值可以成功地区分强致畸类与非致畸类药物，小的倍率变化比值(0.9
代谢组学首次应用于环境毒理学研究起始于Nicholson等[12]采用NMR技术对HgCl2暴露后大鼠血液和尿液的代谢物变化进行检测，发现尿液中肌酸酐和柠檬酸含量降低，而葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和乙酸含量升高；血液中乳酸和肌酸酐升高。从代谢物变化得到的结论与组织病理学观察和尿液中酶活性测定结果一致，同步指示了HgCl2对大鼠的肾损伤作用。自此代谢组学技术逐渐在重金属的毒性效应评估方面有了广泛发展，以英国剑桥大学的Griffin教授为代表的研究团队相继做了一系列重金属毒性效应的代谢组学研究。另一方面，从药物毒性效应的代谢组学评价逐渐发展起来的环境有机污染物毒性评估近年来也得到了发展，尤其是针对持久性有机物污染物(POPs)的毒性评估，采用代谢组学技术进行研究具有很大优势。1.3 代谢组学应用于环境毒理学研究的优势
代谢组学是基因组学和蛋白组学的下游学科，代谢物的变化是机体对环境因素影响的最终应答，由于机体代谢物的变化可灵敏地指示和确证外来干扰在组织和器官水平的毒性效应、以及毒性作用靶位点，因此借助代谢组学技术来评价环境污染物暴露带来的毒性效应，并进而推断其毒性作用的分子机制具有快速、灵敏度高、选择性强等特点，特别是在低剂量或环境剂量污染物的毒性效应评估方面具有很大的优势。
代谢组学技术应用于化学物质的毒性效应评估具有快速和高灵敏度的特征。Robertson等(2000)[13]基于核磁共振技术研究了2种肝毒性物质(四氯化碳和α-萘异硫氰酸)和2种肾毒性物质(2-溴乙胺和对氨基苯酚)对Wistar大鼠尿液代谢物组成的影响，与经典的毒理学研究方法如临床化学和显微镜观察相比，代谢组学技术可以快速灵敏地对毒性物质进行筛查，即使在小剂量暴露水平下，肝毒性和肾毒性物质对大鼠尿液代谢谱也有明显影响。以肝脏胆管毒物α-萘基异硫氰酸酯为例，代谢组学研究显示：4只低剂量(10 mg·kg-1体重(bw))处理的动物在24 h内都表现出明显的代谢紊乱，组织病理学只有2只动物(4 d后)表现出变化，临床化学的方法(血液中胆红素含量)却没有任何变化。中科院水生所研究人员用代谢组学方法评价了微囊藻毒素对肝脏的毒性作用[14]，发现低剂量给药时大鼠肝脏在组织学上没有明显变化，但从代谢层面上已经能引起肝脏的代谢异常：其酪氨酸合成与分解代谢明显受到抑制，3条胆碱相关代谢途径被截断，谷胱甘肽消耗增加，核苷酸的合成紊乱。
代谢组学技术应用于环境污染物的毒性筛查和评估具有较好的选择性。英国帝国理工学院的研究人员[15]在对硫代乙酰胺的肾毒性研究中发现：代谢组学方法能够明确地将肾乳头毒性和近端肾小管毒性区分。用尿液代谢组学方法能够将肝实质毒性和胆管毒性明显区分。Bundy等[16]对3种爱胜蚓属Eisenia fetida、Eisenia andrei和Eisenia veneta进行了代谢表型的研究，发现3种蚯蚓组织提取物的代谢表型极为保守，没有表现出明显的变化；但3种不同爱胜蚓属体腔液代谢物谱有明显的不同。此研究结果表明，在形态学上很难分辨的蚓属在相同的生态环境中可以用代谢组学的方法明确区分。
代谢组学技术应用于于亚慢性毒性或低毒性环境污染物的毒性评价具有很大的优势，是环境低剂量污染物和复合污染物健康风险评估的有效手段。Spann等[17]研究了环境剂量Zn(350 mg·kg-1干重(dw))和Cd(1.5 mg·kg-1dw)对河蚬(Corbicula fluminea)的毒性效应，发现环境剂量Zn不改变河蚬的代谢，而Cd只影响小河蚬的代谢，表现在氨基酸代谢和能量代谢的改变。Geng等[18]采用基于LC/MS/ MS的代谢组学靶标分析对环境剂量(<100 μg·L-1)短链氯化石蜡(SCCPs)的短期暴露对HepG2细胞的代谢干扰进行了研究，发现SCCPs暴露促进了细胞内不饱和脂肪酸和长链脂肪酸的β氧化，使糖酵解和氨基酸代谢紊乱，谷氨酰胺代谢和尿素循环上调，并通过改变细胞的氧化还原状态影响了细胞的增殖活性。代谢组学技术在污染物联合毒性方面也有相关研究，O’Kane等(2013)[19]用低剂量PCB和2,3,7, 8-TCDD(0.1 μg·kg-1TEQ)污染的食物对SD大鼠(Sprague Dawley rat)进行暴露，并对血液小分子代谢物进行UPLC-Q-TOF-MS分析，结果发现PCB和2, 3,7,8-TCDD即使在小剂量暴露下亦会引起大鼠代谢产物的显著性变化。对于组成复杂的复合污染物，采用代谢组学进行毒性评估能够提供指示毒性效应的综合指标。Huang等[20]采用代谢组学方法对组成复杂的大气细粒子PM2.5进行体外暴露，并对模式细胞肺上皮细胞(A549)的代谢变化进行研究，发现PM2.5暴露影响了A549细胞的三羧酸循环、氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢。Chen等[21]通过体外实验对大鼠进行PM2.5暴露发现低剂量PM2.5暴露能够引起与氧化损伤相关的不饱和磷脂酰胆碱含量降低，与炎症相关的溶血磷脂酰胆碱(LPC)显著减少。
2 代谢组学在环境毒理学研究中的应用
2.1 代谢组学技术在重金属毒性评价中的应用
代谢组学技术最早用于环境污染物的毒性评价是从无机金属元素开始的，Gibb等[22]通过检测英国的一些常见无脊椎物种如蚯蚓、土鳖虫、千足虫等组织提取物的变化来指示环境污染情况。如基于核磁共振波谱的代谢组学方法以蚯蚓为模式生物进行Cu和Zn的毒理学研究，发现组氨酸含量与Cu暴露浓度呈正相关关系，可以作为Cu污染的指示性生物标志物，该研究还发现Zn是引起7个不同地区的蚯蚓代谢谱之间差别的主要污染物。Jamers等[23]基于NMR研究了Cu对微藻(Chlamydomonas reinhardtii)的毒性效应，发现当Cu的浓度达到17 nmol· L-1时，微藻体内谷胱甘肽水平下调。Bundy等[24]研究发现在无可见毒性效应水平(NOAEL)和最低可见毒性效应水平(LOAEL)下Cu暴露即可对蚯蚓的能量代谢产生干扰。Ritter等[25]同时从基因和代谢的角度研究了Cu胁迫后褐藻(E.siliculosus)的生物化学变化，发现E.siliculosus自身光合作用改变，小分子代谢物中氧脂素代谢上调，芳香类氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)和支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的增加意味着蛋白质分解代谢的增加；游离脂肪酸(FFA)尤其是FFAC18:3和FFAC20:4的显著增加表明ROS参与的脂质过氧化过程增加。从基因分析的结果可以看出，ROS解毒系统和肌醇信号通路被激活。
另外，英国剑桥大学的Griffin教授带领的研究团队在重金属毒性效应的代谢组学评价方面做了一系列的研究工作。Griffin等(2000)[26]观察到低剂量CdCl2暴露(肾脏浓度为8.4 μg·g-1dw)引起沙鼠的生物化学变化包括脂类和谷氨酸代谢。在另一篇文章中，Griffin等(2001)[27]基于NMR研究了CdCl2暴露对SD(Sprague Dawley)大鼠尿样的代谢干扰，发现甘油三酯水平发生变化，经过19 d的暴露，低剂量组和高剂量组(8 mg·kg-1和40 mg·kg-1食物)大鼠均出现肌酸尿和柠檬酸结合物增加的现象。94 d暴露后血液Ca2+/Mg2+降低，另外还发现Cd暴露会引起肾脏细胞出现酸中毒。Jones等(2007)[28]在研究啮齿类动物对Cd暴露的代谢响应时也发现了同样的现象。Griffin等(2001)[29]基于NMR研究了As2O3(28 mg·kg-1食物)对沙鼠的毒性作用，发现该剂量As2O3暴露能够引起肾组织损伤和脂质代谢异常。Wu等[30]基于NMR的代谢组学方法研究了不同盐度下As暴露对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)的毒性效应，发现在高盐度下(31.1 μg·L-1)As暴露降低了蛤仔体内氨基酸(如谷氨酸、β-丙氨酸等)的含量，同时增加甜菜碱和延胡索酸的含量；在中等盐度下(23.3 μg·L-1)，As导致的代谢变化包括苏氨酸、组氨酸、ATP和延胡索酸的降低；而低盐度下(15.6 μg·L-1)，只有ATP含量增加，琥珀酸减少。表明低盐度条件下As暴露改变能量代谢，而中高盐度条件下除了能量代谢变化，渗透压也发生改变。Holmes等(2000)[31]采用基于HMR的代谢组学技术寻找肝毒性(联肼)和肾毒性物质(HgCl2)对大鼠毒性作用的标志物，尿样中牛磺酸、α-丙氨酸、肌酸和2-氨基己二酸水平的升高可以作为联肼肝毒性的标志，而尿样中氨基酸、有机酸和葡萄糖水平升高，同时柠檬酸、琥珀酸、马尿酸和2-氧戊二酸的降低可以作为HgCl2肾损伤的标识。
Sun等(2010)[32]利用GC-TOF-MS技术系统研究了镉胁迫对拟南芥小分子代谢物的影响，发现镉胁迫可以引发一系列诱导反应，β-丙氨酸、脯氨酸、腐胺、4-氨基丁酸、蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉子糖、a-生育醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和异黄酮等化合物均有显著升高，并首次发现镉胁迫显著影响拟南芥中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量。Lenz等[33]同时用NMR和HPLC-TOF/MS对HgCl2暴露后大鼠尿液中代谢物的变化进行研究，在暴露后的时间序列变化中NMR和HPLC-TOF/MS分析均发现HgCl2暴露对大鼠的显著干扰发生在暴露后第3天，NMR和HPLC-TOF/MS鉴定出的代谢物有所不同，二者在代谢组学研究中可以相互补充。Dudka等[34]采集了健康人群和长期暴露于重金属As、Cd和Pb的职业工人尿液，并基于NMR对其小分子代谢物进行分析，发现As、Cd和Pb的联合暴露显著改变了人体的能量代谢，另外，以极低密度脂蛋白和低密度脂蛋白为代表的脂类物质和氨基酸类物质也发生显著变化。Bundy等[35]研究了在不同程度金属污染的环境中一种蚯蚓种属(Lumbricus rubellus)的代谢物变化，发现蚯蚓体内麦芽糖含量的升高可作为指示金属污染的潜在生物标志物。Wu等[36]用代谢组学方法对稀土Ce(NO3)3的急性毒性进行了研究，发现Ce(NO3)3使大鼠脂肪酸β氧化功能受到抑制，表现为大鼠尿液中一系列小分子代谢物出现剂量依赖性减少，血清中的丙酮、乙酰乙酸、乳酸盐和肌酸酐升高。Zhu等[37]基于NMR分析了健康人群和接触高硒环境的人群尿液代谢谱的变化，发现过度硒接触会引起尿液中甲酸、乙酸、乳酸、马尿酸和丙氨酸含量的升高，同时柠檬酸、肌酸和氧化三甲胺的含量降低，这些显著变化的代谢物与肾脏和肝脏病变有关。
2.2 代谢组学技术在有机化合物毒性评价中的应用
近年来，也有报道用代谢组学技术研究有机化合物的毒性效应。Vulimiri等(2011)[38]认为代谢组学方法在外源性物质的毒性作用方式研究方面具有独有的优势。并以四氯化碳为例详细阐述了其毒性作用机制为CCl4被细胞色素P450酶代谢形成的·CCl3自由基，与氧结合形成的自由基·O-O-CCl3能够氧化内质网或者细胞膜的多不饱和脂肪酸，并开启一个脂质过氧化的自催化过程，形成更多的自由基带来细胞膜损伤。Garrod等[39]用代谢组学的方法研究了2-溴乙胺的肝毒性和肾毒性，暴露后6 h和12 h均发现肾乳头渗透因子如甘油磷酰胆碱、甜菜碱和肌醇降低，伴随肌酸含量升高。暴露后4 h和6 h，发现各个组织戊二酸水平增加。这一结果表明线粒体脂酰辅酶脱氢酶被抑制导致线粒体功能紊乱。暴露后6 h，肾皮质氧化三甲胺水平增加，肝组织代谢物谱的变化表现在甘油三脂、赖氨酸和亮氨酸增加。Waters等[40]对α-萘基异硫氰酸酯(ANIT)对雌性HW大鼠(Han-Wistar Rat)的毒性作用进行了代谢组学评价，综合分析了肝脏、血液和尿液的小分子代谢物，发现ANIT导致的代谢紊乱包括与脂沉积症相关的高血脂、高血糖和尿糖；肝脏胆汁酸增加，牛磺酸和肌酸的尿液排泄量增加；另外，血液尿酮增加，通过尿液排泄的三羧酸循环中间体如琥珀酸、2-氧戊二酸和柠檬酸降低表明能量代谢发生改变。Garrod等[41]研究了单剂量联肼暴露(90 mg·kg-1bw)对SD大鼠的毒性作用，24 h后，测得肝组织中甘油三酯、β-丙氨酸含量显著增加，同时肝糖原、葡萄糖、胆碱、牛磺酸和氧化三甲胺水平降低。
持久性有机污染物(POPs)具有亚慢性毒性，采用代谢组学对其毒性效应进行评估能够进一步认识其毒性作用机制。Jones等(2008)[42]用代谢组学方法研究了蚯蚓(L.rubellus)对多环芳烃(芘)暴露的响应，发现暴露剂量在40 mg·kg-1时蚯蚓体内乳酸和饱和脂肪酸水平下降，氨基酸水平升高，表明葡萄糖代谢和三羧酸循环受到干扰，脂肪酸代谢增加。Whitfield Åslund等[43]将蚯蚓(Eisenia fetida)暴露于亚致死剂量的多氯联苯，发现高剂量组蚯蚓的代谢谱中ATP和多种氨基酸含量显著升高，葡萄糖和麦芽糖显著降低，蚯蚓的能量代谢和细胞膜渗透功能发生改变。Zhang等(2012)[44]基于LC-MS/MS研究了2,3,7,8-TCDD短期暴露对HepG2细胞内小分子代谢物的影响，发现TCDD使HepG2细胞内脯氨酸和谷氨酸的合成能力下降，另外TCDD可刺激HepG2细胞对缬氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的吸收。Ji等(2013)[45]研究了蚯蚓(Eisenia fetida)对PBDE的代谢干扰，发现BDE47主要干扰能量代谢，引起渗透压改变。代谢干扰的标志物有甜菜碱、甘氨酸、2-己基-5-乙基-3-呋喃硫酸钠。Lankadurai等(2012)[46]研究了蚯蚓(Eisenia fetida)对PFOA和PFOS的代谢干扰，PFOA暴露浓度为6.25到50 μg·cm-2，PFOS暴露浓度为3.125到25 μg·cm-2。发现亮氨酸、精氨酸、谷氨酸、麦芽糖和ATP是PFOA和PFOS暴露的潜在指示物。PFOA和PFOS暴露还会损伤线粒体内膜结构，从而增加脂肪酸氧化，干扰ATP合成。Zeng等(2013)[47]研究了BPA(1、10和100 μg·kg-1bw)对SD大鼠尿液代谢物的干扰，42种代谢物发生显著变化，受到影响的代谢通路包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成，谷氨酰胺和谷氨酸代谢等。神经递质以及与神经传递相关代谢物的改变表明小剂量BPA的毒性作用在于干扰神经系统。陈蓉等[48]基于LC-MS研究了多氯联苯(PCBs)和二噁英(2,3,7,8-TCDD)及其联合染毒对大鼠的代谢影响，暴露剂量为TCDD(10 μg·kg-1bw)、PCBs(10 mg·kg-1bw)及其混合溶液(10 μg·kg-1bw TCDD和10 mg·kg-1bw PCB)，其毒性大小为：联合染毒>TCDD>PCBs，PCBs和TCDD能导致免疫系统、肝脏和神经系统障碍、干扰脂代谢。
2.3 代谢组学技术在环境胁迫耐受性评价中的应用
环境胁迫如温度剧烈变化、缺氧、干旱、饥饿等因素均可引起机体的应激反应，目前研究人员已经以不同植物(拟南芥、藻类、狗牙根、复原草、豆科植物、云杉)和动物(麻蝇、果蝇、鱼类、蚯蚓和人体)为模式生物开展了一系列代谢组学研究。发现代谢组学方法可以实时监测这些环境胁迫所导致的生物体变化。Vaclavik等[49]基于LC-MS和DART-MS研究了拟南芥的低温耐受性，发现3-丁烯基硫甙为冷敏感性物质，而黄酮甙类物质(flavon-3-ol glycosides)为冷耐受性物质。Nair等[50]基于代谢组学和转录组学研究发现添加LPC后能够增加拟南芥细胞液中水溶性糖、糖醇、有机酸以及脂肪酸的含量来对抗寒冷，转录组发现的变化也证明了这个规律。Shi等[51]利用代谢组学和蛋白组学对CaCl2在狗牙根(Cynodon dactylon(L.)Pers.)应对寒冷环境中的作用做了研究，发现CaCl2能够通过激活抗氧化剂，调整相关差异表达蛋白和代谢稳态来应对寒冷。具体表现在CaCl2处理后狗牙根体内由寒冷导致的活性氧(ROS)和细胞损伤减轻；与氧化还原反应、三羧酸循环、糖酵解、光合作用、氧化磷酸戊糖途径和氨基酸代谢相关的51个蛋白上调；42个小分子代谢物包括氨基酸、有机酸、糖和糖醇发生显著变化。Angelcheva等[52]采用GC-MS研究了西伯利亚云杉在适应寒冷不同阶段的代谢变化，正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)表明不同适应期(预适应期、适应前期、适应后期和完全适应期)云杉针叶的代谢物谱能够完全分离，糖类和脂类代谢物变化最为明显，包括棉子糖中低聚糖的合成和积累增加，糖酸和糖醇以及双半乳糖甘油增加，长链单不饱和、多不饱和脂肪酸在适应过程中也逐步增加。
Zhang等(2011)[53]利用GC-TOF-MS结合LCMS/MS研究了硫缺乏对拟南芥代谢轮廓的影响，共鉴定出90个代谢物，其中有31个代谢物对硫缺乏表现出特征响应，含量呈现明显增加，而鸟氨酸和果糖含量显著降低。Ren等[54]通过基因敲除探讨了Slr1909在集胞蓝藻(PCC6803)对酸容忍性调节中的作用，蛋白组学研究发现Slr1909缺失的蓝藻中有24种蛋白显著上调，10种蛋白显著下调，代谢组学研究发现单糖和脂肪酸是区分Slr1909缺失蓝藻和正常蓝藻对酸容忍度不同的关键代谢物。Yobi等[55]基于GC-MS和LC-MS研究了复原草的耐干旱机制，发现在干旱状态下富氮氨基酸和γ-谷酰基氨基酸、瓜氨酸、核苷酸分解代谢产物如尿囊素含量的增加能够在水合过程和活性氧去除过程中发挥重要作用；另外，紫外保护化合物如3-(3-羟苯基)丙酸酯、芹黄素和4,5,7-三羟黄烷酮丰度增加，而除磷酸胆碱之外的大多数脂类化合物含量减少有助于细胞膜的水合稳定。总体而言，高丰度糖、渗透压调节物质、抗氧化剂、遮光剂共同促进了复原草的耐脱水性。Nguyen等[56]用基因敲除法研究了MtP5CS3基因在豆科植物蒺藜苜蓿的高耐性中发挥的作用，代谢组学分析发现，氨基酸、糖类、多元醇等物质在蒺藜苜蓿根部的大量富集以及另外一些氨基酸在干旱和高盐胁迫下含量的降低增加了MtP5CS3基因突变种蒺藜苜蓿的高耐性，但是这些代谢改变弥补不了MtP5CS3基因缺失带来的脯氨酸缺乏故而使蒺藜苜蓿耐受性减弱。
Teets等[57]采用基因组学和代谢组学研究了麻蝇耐寒的分子生物学机制，细胞分子支架重组(相关基因上调)和细胞信号通路协调(相关代谢改变)是麻蝇应对寒冷损伤的主要机制。Coquin等[58]通过对果蝇的代谢组学研究发现：随着年龄增加，果蝇对低氧忍受能力降低主要是ATP产生降低，这与线粒体呼吸作用的减弱和对伴随乙酸生成的能量代谢途径的过分依赖有关。Feala等[59]在代谢组学研究中发现在低氧条件下果蝇体内乳酸、丙氨酸和乙酸含量增加。Viant等[60]基于NMR研究了虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)在热应激下的代谢反应，发现热应激蛋白hsp72和hsp89的表达增加与能量代谢物质如磷酸肌酸、三磷酸腺苷和糖原含量的降低呈正相关关系。Warne等[61]对2种蚯蚓(Eisenia veneta和Lumbricus terrestris)应对饥饿胁迫的代谢变化进行了研究，E.veneta在饥饿胁迫5 d内代谢物变化很小，但是第6、7天出现代谢物显著变化：包括谷氨酸、柠檬酸、天冬氨酸、异亮氨酸含量的增加以及赖氨酸、缬氨酸和苏氨酸含量的降低；而L.terrestris在短期饥饿胁迫期间小分子代谢物没有显著变化，L. terrestris的这一特征更适用于土壤的毒理学研究。Spegel等[62]对口服葡萄糖耐量试验后2 h内人体血浆的代谢谱变化进行分析，发现脂肪酸和氨基酸含量均显著降低，但是由于影响氨基酸变化的生物学因素很多，故脂肪酸被认为代谢调整的指示物。
3 展望
近年来，代谢组学依赖高通量、高分辨率的分析技术与完整的生物信息学系统相结合，在环境毒理学研究中得到了快速发展，为人们更加清楚地认识机体应对环境因素变化的机理提供了一种新的有效的手段。但到目前为止代谢组学应用于环境毒理学尚存在以下不足：
(1)先进的代谢组学分析技术多掌握在分析化学家手中，而代谢物变化所指示的生物学意义却更为生物学家所熟知，这在一定程度上限制了代谢组学在环境毒理学研究中的应用，所以代谢组学生物信息学这一交叉学科的发展，能够为代谢组学在各个学科中的应用提供更广阔的空间。
(2)代谢组学在环境毒理学中的应用还缺乏规范性的指导方针。目前还未建立环境污染物低剂量长期暴露和不同靶器官毒性物质毒性效应评估的试验规范：包括模式生物选择(体内和体外)、暴露方式确定(暴露剂量和暴露时间)、高通量代谢组学方法建立和代谢产物鉴定、以及针对不同模式生物代谢变化的系统生物学解析。这一系统工作尚需长期的研究和探索。
(3)代谢组学研究需要与传统毒理学方法相结合，借助传统毒理学的毒性终点有助于寻找污染物暴露的生物标志物，建立针对不同种类毒性物质的代谢物靶标分析方法和生物标志物指示体系。另外，代谢组学与基因组学和蛋白组学相结合，将会成为一种有力的工具，其高通量筛选特征必将为毒理学风险评估提供综合视角，成为毒理学发展的必然趋势。
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A Review on the Application of Metabonomic Approaches in Environmental Toxicology
Geng Ningbo1,Zhang Haijun1,#,Wang Feidi1,2,Ren Xiaoqian1,2,Zhang Baoqin1,Chen Jiping1,*
1.Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,Dalian Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023,China
2.Graduate School of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China
18 January 2016 accepted 18 February 2016
Metabolomics is an important aspect of systems biology.It concerns with the dynamic changes of endogenous metabolites in body fluids or tissues of organism affected by internal and external factors.Bioinformatic tools are then employed to bring insights into the pathophysiological processes and toxicological mechanisms. Metabolomics is a fast and high-throughput method with the characteristics of high sensitivity and selectivity,and so it plays an increasing advantage in the toxicity assessment of low-dose environment pollutants.In this review, the analytical methods,development history and advantage of metabolomics on toxicology research,as well as its application and perspective in environmental toxicology were introduced.This review mainly focused on the application of metabolomics approach in the risk assessment of heavy metals and persistent organic pollutants(POPs),and the metabolomic responses of orgnisms to environmental stress.
metabonomics;environmental toxicology;NMR;LC/GC-MS;environmental stress
2016-01-18 录用日期：2016-02-18
1673-5897（2016）3-026-10
X171.5
A
10.7524/AJE.1673-5897.20160118001
简介：陈吉平(1964-)，男，分析化学博士，研究员，主要从事环境分析化学与环境健康相关的基础与应用研究，发表学术论文100余篇。
张海军(1974-)，男，生态学博士，研究员，主要从事环境化学与环境毒理学相关的研究工作，发表学术论文70余篇。
国家自然科学基金委联合重大研究计划(91543201)；国家自然科学基金(21277141，21337002)
耿柠波(1985-)，女，博士研究生，研究方向为环境毒理学，E-mail:gengningbo@dicp.ac.cn
*通讯作者（Corresponding author），E-mail:chenjp@dicp.ac.cn；
#共同通讯作者(Co-corresponding author)，E-mail:hjzhang@dicp.ac.cn；
