噬藻体遗传多样性及其分子生态学研究现状与展望

江苏大学环境与安全工程学院, 镇江 212013

高恶斌*, 董一鸣

噬藻体遗传多样性及其分子生态学研究现状与展望

江苏大学环境与安全工程学院, 镇江 212013

高恶斌*, 董一鸣

高恶斌, 董一鸣. 噬藻体遗传多样性及其分子生态学研究现状与展望[J]. 生态科学, 2016, 35(2): 166-173.

GAO Ebin, DONG Yiming. Advances in researches on cyanophage genetic diversity and molecular ecology[J]. Ecological Science, 2016, 35(2): 166-173.

噬藻体是水体微生物群落中的重要活性成分, 广泛存在于海洋及淡水环境中, 对蓝藻种群结构与多样性以及水生态环境具有重要影响。开展水环境中噬藻体遗传多样性研究将有助于噬藻体资源的开发与利用。从分子生态学角度, 论文对噬藻体遗传多样性研究的分子基础与分子标记等进行了综述, 并简要概述了相关研究方法的基本概念及其应用状况。从分子生态学与噬藻体多样性研究相结合的层面, 对该领域的未来研究进行展望。

噬藻体; 辅助代谢基因; 遗传多样性; 分子生态学; 蓝藻

1 前言

噬藻体是侵染蓝藻的病毒, 虽然个体极其微小, 但数量巨大, 是水体微生物群落中重要的活性成分[1–2]。它们广泛分布于全球各种天然水体中, 具有丰富的遗传多样性[3]。在水生态系统中, 噬藻体与宿主蓝藻相互作用, 可调控蓝藻种群结构与多样性、参与生物地球化学循环以及介导微生物之间水平基因转移[4–6], 尤其是为预防蓝藻水华提供了新的途径[7]。如今, 噬藻体被看成是一种不可忽视的战略资源[1], 倍受国内外学者的高度关注, 并成为病毒学与生态学研究相互渗透而成的一个新的研究热点。

由于传统微生物分离培养技术的限制, 自然水环境中大多数噬藻体都是处于未纯培养的状态, 难以全面地认识噬藻体多样性及其生态作用。近年来有关海洋及淡水环境中噬藻体的研究大多是从分子生态学的角度出发, 对噬藻体群落结构及其遗传多样性进行研究。分子生态学作为一门新兴学科, 将分子生物学方法与生态学理念有机结合, 为噬藻体多样性研究提供了新的方法, 有助于深化人们对于噬藻体生物资源及其生态功能的认识。本文从分子生态学的角度, 结合分子生物学及其相关技术, 对噬藻体多样性研究进行综述与展望, 旨在为开发利用噬藻体生物资源提供参考。

2 噬藻体遗传多样性的分子基础

噬藻体是地球生物圈内一类古老的微生物, 在长期的进化过程中, 为逃避宿主免疫系统或提高自身生态适应性, 以不同方式如基因交换重组不断获取部分外源DNA片段。这些获得的外源核酸物质不仅使得噬藻体自身遗传物质结构发生改变, 而且为丰富噬藻体遗传多样性提供了分子基础。由于物种种内个体之间的遗传结构差异程度是其遗传多样性的重要表现, 因此, 测定噬藻体基因组序列并分析其结构特征与基因组成, 可获得噬藻体生物学功能及其遗传多样性的相关数据。随着分子生物技术的迅速发展, 一系列海洋噬藻体基因组序列被测定[8–14],为深入开展噬藻体生态学特性、亲缘关系及分类等相关研究提供了重要的遗传信息。Chen等[8]通过测定海洋短尾噬藻体P60基因组序列并分析其序列特征, 发现了短尾病毒科噬藻体DNA复制系统比肌病毒科和长尾病毒科噬藻体要保守的多, 且将DNA复制系统作为裂性噬藻体的判断标准, 在分子水平上证实P60是一种裂性噬藻体。Weigele等[9]发现T4噬藻体Syn9基因组具有不同于T4噬菌体的DNA复制模式, 而且Syn9可利用同源蛋白组装成与噬菌体 SP01和疱疹病毒有相同拓扑学特征的衣壳整体结构。对长尾噬藻体 P-SS2测序结果显示, 基因组中含有int,bet,exo和一个53bp的结合位点等遗传机制, 由此推测噬藻体 P-SS2可能长期与宿主进行基因片段整合[10]。近年来, 不少研究对淡水噬藻体基因组进行了一些相关报道[15–20], 并获得了有关淡水噬藻体基因组特征及其多样性的遗传信息。日本学者 Yoshida等[15]首次详细报道感染铜绿微囊藻的肌尾噬藻体Ma-LMM01基因组, 该噬藻体基因组中含有位点特异重组酶(site-specific recombinase)、抗阻遏物激活因子(antirepressors)以及与宿主高度同源的转坐酶等有关的编码基因, 表明Ma-LMM01基因不仅可整合到宿主基因组内, 而且还可能与其宿主发生基因传递。在国内噬藻体研究方面, 刘新尧等[16–17]先后测定了两株感染相同宿主蓝藻的短尾噬藻体Pf-WMP4和Pf-WMP3基因组序列, 尽管它们基因组特征差异明显, 但却有相同的形态学结构、结构蛋白 SDS-PAGE条带及氨基酸序列和右臂基因结构。黄思军等[18]测定了四株长尾噬藻体 S-CBS1, S-CBS2, S-CBS3, S-CBS4基因组序列, 并与海洋长尾噬藻体 P-SS2进行比较分析, 揭示了长尾噬藻体具有显著的遗传多样性。2012年, 高恶斌等[24]完成一株无尾噬藻体 PaV-LD的测序, 在基因水平证实了该噬藻体缺少尾部相关基因, 表明了自然环境中噬藻体形态丰富多样。

研究表明, 噬藻体与宿主蓝藻之间的水平基因转移是导致噬藻体遗传多样性的一个重要原因[28]。通过对已测序噬藻体基因组序列分析, 研究人员发现大多数噬藻体携带一些与宿主蓝藻具有高度相似的代谢相关基因序列[8–15,19–20 ]。这些代谢相关的基因被看成是噬藻体特有基因, 仅存在噬藻体基因组中, 而噬菌体或其它病毒基因组从未发现。这些代谢相关的基因序列可能是通过噬藻体与宿主之间的遗传物质交换而获得, 与宿主蓝藻的新陈代谢和生命循环有着密切的联系[18,26]。2005年, Sullivan等[13]测定了3株海洋噬藻体P-SSP7、P-SSM2和P-SSM4基因组序列, 分别发现它们7%、11%、12%的基因组序列编码与蓝藻基因高度同源的序列, 如光合系统II核心蛋白D1、D2(psbA、psbD), 强光诱导蛋白(hli),质体蓝素蛋白(petE), 铁氧化还原蛋白(petF), 藻胆红素合成酶(pebA), 血红素氧合酶(ho1), 聚胺合成酶(speD), 藻胆蓝素:铁氧还蛋白氧化还原酶(pcyA),以及转醛醇酶基因(talC)等, 其中噬藻体P-SSM2和P-SSM4还含有磷酸盐诱导基因(phoH,pstS)和催化维生素B12合成蛋白基因(cobS)。2010年, Sullivan等[25]对16株肌尾海洋噬藻体基因组序列进行了比较分析,发现25个噬藻体特有基因, 包括之前报道过的光合作用相关基因、磷压力诱导基因以及氮代谢有关的核心基因。在淡水噬藻体基因组序列中, 研究人员还找到了可降解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物的nblA必需基因[15,19–20]。这些代谢相关基因一方面可能与噬藻体适应特殊的生态环境与宿主生理状况有关,另一方面它们改变了噬藻体基因组结构与组成, 是导致噬藻体遗传多样性的重要因素之一[28]。

3 噬藻体遗传多样性的分子标记

噬藻体在形态上属于有尾DNA病毒科成员, 包括肌尾噬藻体、短尾噬藻体及长尾噬藻体, 在各种水域广泛分布, 且丰度极高。它们缺少统一的保守序列, 在遗传多样性研究方面还存在一定的局限性,因而选择适合的靶基因成为噬藻体分子生态学研究的关键。目前对水体中噬藻体多样性的认识主要基于DNA聚合酶、结构蛋白以及部分辅助代谢基因(AMGs)等遗传标记的基因多样性研究。

3.1 结构蛋白基因

通常, 某些编码结构蛋白的基因在特定噬藻体种群中具有高度保守性[29–30], 被作为靶标基因用于研究噬藻体种群结构、遗传差异与多样性。Fuller 等[29]在海洋肌尾科噬藻体中发现了一段编码结构蛋白基因g20的保守序列, 并根据该基因序列设计出了一系列的引物, 自此开始了在分子生物学水平上对噬藻体遗传多样性的研究。目前, g20基因已成功被用于各种海洋、湖泊及稻田等水体中的噬藻体遗传多样性研究[22,31–35], 并获得了大量的研究数据。其分析结果显示, 水体中噬藻体的遗传多样性相当丰富, 且不同水体之间噬藻体遗传多样性差异非常明显。Zhong等[34]利用g20基因对河口和寡营养海域的噬藻体进行遗传多样性的研究, 共得到了114个噬藻体g20基因的系统分类单元(OTUs), 其中噬藻体遗传多样性最丰富的1个水体样本中得到了29个OTUs。通过对这114个噬藻体g20基因的OTUs之间以及同已获得纯培养的噬藻体的g20序列进行亲缘关系的比较分析, 建立了9个海洋肌尾科噬藻体序列簇。Dorigo等[36]采用克隆及PCR-DGGE 技术从法国最大的自然湖-泊布尔热湖得到47条噬藻体g20序列, 得到了35种不同的噬藻体基因型, 并将它们分为7个分类单元(OTUs), 系统发育分析发现一些OTUs与海洋的噬藻体序列具有同源性, 而一部分OTUs仅分布于淡水湖泊环境中。Jiang等[22]等调查研究了我国稻田水体中噬藻体g20基因多样性及其分布规律, 发现水体存在3个新的g20基因类群, 并采用UniFrac方法分析噬藻体g20基因群集发现, 噬藻体群落结构在海洋、湖泊及稻田环境中存在显著的差异, 而且在不相同的稻田水体环境中噬藻体群落结构也不同。Butina等[21]利用g20基因序列片段研究贝加尔湖海绵噬藻体群落特征, 揭示了贝加尔湖海绵具有其特有的、且明显不同于贝加尔湖的噬藻体群落结构与组成。

除结构蛋白基因g20外, 主要衣壳蛋白基因g23在肌尾病毒科噬藻体中同样具有高度保守性[37,38]。Butina等[39]采用g23基因研究贝加尔湖水样中噬藻体多样性, 发现该湖中g23基因的多样性极其丰富,并进行了分类, 结果表明几乎所有g23序列与海洋和稻田环境中的T4噬藻体及未知病毒高度相似。López-Bueno等[40]在南极一个淡水湖中检出多种g23基因, 结果同源性较低, 其编码氨基酸的序列与大多数已知同类基因的序列相似性低于80%。此外, Kimura等[41]采用噬藻体尾鞘基因(g91)揭示了微囊藻噬藻体在环境中具有极其丰富的遗传多样性, 并推测淡水环境内的噬藻体类群明显不同于海洋环境中的噬藻体类群。

3.2 DNA聚合酶

DNA聚合酶是DNA复制所需的一种生化酶, 在短尾噬藻体基因组中具有一定的保守性, 成为短尾噬藻体多样性及其亲缘关系研究的主要分子标记。Labonte和Chan等[42–43]先后从肌尾和短尾病毒科的噬藻体中鉴定了DNA聚合酶基因和线粒体DNA聚合酶基因, 并发现加拿大乔治亚湾及墨西哥东北部湾的短尾科噬藻体分布非常广泛, 且具有丰富的遗传多样性。Chen等[44]根据海洋短尾科噬藻体DNA聚合酶基因序列设计兼并引物, 对美国切萨皮克海湾夏、冬两季表层、中层及底层水中的短尾噬藻体的多样性进行研究, 揭示该海域短尾噬藻体相当丰富,且其种群结构及多样性呈现出明显的季节性变化。黄思军等[45]利用DNA聚合酶基因序列对世界多处采集病毒样品进行扩增, 揭示了全球海洋中短尾噬藻体的广泛分布。最近, Wang等[46]采用DNA聚合酶基因研究了我国武汉东湖短尾噬藻体的遗传多样性及其动态变化, 并根据DNA聚合酶基因序列系统发育树分析, 发现该湖泊内大部分短尾噬藻体与海洋短尾噬藻体具有较近的亲缘关系。

3.3 辅助代谢基因(AMGs)

近年来, 噬藻体辅助代谢基因AMGs被作为成为一种辅助方法, 用于研究噬藻体遗传多样性及其在进化过程中与蓝藻之间的相互关系。它们是噬藻体编码的一类特殊功能基因, 且不属于某一特定形态噬藻体, 将其作为噬藻体检测的分子标记, 不仅有助于全面认识环境中噬藻体种群结构及遗传多样性, 而且有助于了解噬藻体的感染复制机制及其与水华蓝藻生理状况的密切联系。目前, 被作为标靶基因的辅助代谢基因, 主要包括光合作用基因(psbA/psbD)、焦磷核苷酸水解酶基因(mazG)及磷酸盐诱导基因(phoH)等。光合作用基因psbA、psbD分别编码光系统Ⅱ反应中心的的D1和D2蛋白, 是宿主光调控的关键基因[47], 其序列具有一定的保守性。Sullivan等[13]利用光合基因psbA对海洋及淡水噬藻体的遗传多样性进行研究, 发现海洋噬藻体具有不同于淡水噬藻体的进化过程, 而且同一地理区域的噬藻体psbA基因结构也存有差异。Che′nard等[48]根据psbA基因序列对海洋及淡水噬藻体的遗传多样性进行研究, 并构建了系统发育树, 结果也表明海洋噬藻体具有不同于淡水噬藻体的进化历程。此外,他们还发现噬藻体psbA基因与蓝藻psbA基因同属一进化枝, 由此推测噬藻体携带的光合基因可能来源其宿主。Bryan等[49]利用焦磷核苷酸水解酶基因(mazG)揭示了噬藻体呈全球性分布, 并根据mazG基因构建了噬藻体与其宿主蓝藻的进化发育树, 推测噬藻体的mazG基因可能不是从其宿主中获得。Goldsmith等[50]采用磷酸盐诱导基因phoH作为分子标记用于海洋病毒多样性分析, 发现phoH基因具有丰富的序列多样性, 而且大多数序列与已知序列不同。此外, 他们还发现海洋病毒似乎依据它们宿主的不同营养方式进行相似聚类, 其中噬藻体具有独立的系统进化枝, 明显有别于海洋噬菌体及藻病毒。

4 噬藻体遗传多样性的分子方法

噬藻体在自然环境中的种群组成及时空分布是噬藻体分子生态学研究的重要内容。由于传统的监测与鉴定方法在环境样品中应用效率低, 容易丢失一些重要的遗传类型, 对现场样品的原位(in situ)研究存在很大的局限性。分子方法相对准确且快速,并克服了传统方法应用上的不足, 为研究噬藻体多样性、时空分布及其与环境因子动态变化的关系提供了新的检测手段。目前已被用于研究噬藻体多样性的分子生态学方法主要包括: 克隆文库(Cloning library)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis)、DNA指纹图谱(DNA Fingerprinting)、宏基因组文库(Metagenomics library)等。

4.1 克隆文库

克隆文库分析方法是首先从环境样品中提取出浮游病毒基因组总DNA, 利用针对病毒的标记基因序列设计通用引物对样品总 DNA进行 PCR扩增, 将PCR产物与合适的克隆载体连接, 并转化感受态细胞, 得到大量含有不同标记基因序列的转化子,然后对这些转化子的标记基因序列采用测序技术或PCR/RFLP进行定性分析。通过针对g20基因序列并构建克隆文库, 研究发现河口与开放海域间蓝藻病毒种类组成及结构完全不同, 同一位点处不同深度差异也很大[34]。Wilhelm等[31]依据g20基因序列构建加拿大 Laurentian湖中聚球藻噬藻体的克隆文库, 分析发现噬藻体广泛分布于该湖的东、中和西部, 而且淡水噬藻体与海洋噬藻体的遗传多样性有很大的相关性, 但是又各成一支, 推测其原因是与它们感染的蓝藻宿主有关。根据克隆文库分析结果, Labonté等[42]发现加拿大乔治亚湾及墨西哥东北部湾的短尾科病毒分布非常广泛, Che′nard等[48]发现海洋噬藻体具有不同于淡水噬藻体的进化过程, 且推测噬藻体携带的光合基因来源其宿主。

4.2 脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶电泳(PFGE)是一项借助于有规律地改变电场方向而使大分子 DNA得以分离的电泳技术, 被广泛应用于所有的生物基因组结构和功能的研究。由于该技术具有重复性好、分辨力强、易标准化等优点, 结果准确稳定, 不受表型形状干扰,被认为是进行分子生物学分型的可信方法之一, 为确定同种生物之间的亲缘关系提供了可靠的技术支持。目前, PFGE技术已广泛用于研究不同水体中病毒基因组的大小、丰度及不同基因组大小病毒与环境因素间的相互关系。Sandaa与Larsen利用PFGE技术发现挪威海岸水域中的病毒群落多样性十分丰富[51], 并呈现明显的季节性动态变化。刘艳鸣等[52]采用PFGE揭示中国武汉东湖存在5种不同大小的病毒基因组, 大小范围在15～300kb之间, 并证实了噬菌体和噬藻体是构成东湖中浮游病毒群落的优势类群。为了探索自然环境中噬藻体光合作用基因及其多样性, Sandaa等[53]采用噬藻体光合作用基因引物进行PCR检测, 结果发现PFGE分离的病毒中多数都含有psbA和psbD, 两类病毒只含有psbA, 一类病毒只含有psbD。

4.3 DNA指纹图谱

DNA指纹图谱是用PCR扩增浮游病毒样品总DNA的标记基因序列, 然后用合适的电泳技术将其分离而成的具有特定条带特征的图谱。DNA指纹模式的不同就反映种群结构的不同。按分离依据不同, DNA指纹图谱可分为限制性酶切片段长度多态性图谱(RFLP)、末端限制性片段长度多态性图谱(T-RLFP)、随机扩增多态性DNA图谱(RAPD)和变性梯度凝胶电泳图谱(DGGE)。Marston等[54]利用RFLP技术研究美国罗德洲近海海域噬藻体遗传多样性时, 鉴定了36种不同肌尾噬藻体的g20基因型, 而推测短尾噬藻体与长尾噬藻体是该海域内噬藻体种群的主要成员。Winget等[55]采用RAPD-PCR评估Chesapeake海湾中噬藻体群落的丰富度动态变化, 揭示了噬藻体多样性的时间变化要比空间变化更加明显。Wilson 等[56]针对DNA多聚酶基因片段, 采用PCR-DGGE技术揭示了福克兰群岛到英联合王国的大西洋横断面噬藻体的遗传多样性及结构组成与水体分层密切相关。

4.4 宏基因组学

宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中特定微生物群落的基因组总DNA, 克隆到合适的载体, 转化宿主细胞, 形成一个高度复杂的重组DNA文库, 从文库中获得相关基因, 避免了传统微生物学基于分离培养研究的限制。宏基因组学不仅可以提供自然环境中浮游病毒的群落结构及多样性数据, 而且可以提供一些潜在的病毒种群结构数据。Sharon等[57–58]通过比较分析环境病毒宏基因组文库序列, 获得一系列与光合系统I(PSI)相关的基因序列,并揭示了光合系统基因在噬藻体中普遍存在。Ma等[23]利用宏基因组技术研究了近海水域噬藻体的多样性及其基因组动态变化, 并依据T4噬菌体核心基因构建系统进化树, 揭示海洋中未知噬藻体的多样性非常丰富。Hevroni等[24]利用宏基因组结合PCR的方法对太平洋噬藻体光合基因的多样性进行研究, 揭示了光合系统PSII与PSI基因的水平能够促进噬藻体的生态适应性, 且推测噬藻体PSI基因的多样性远比起初我们估计得还要丰度。Roux等[60]运用宏基因组学方法对两个淡水湖中的病毒群落进行了分析,结果显示淡水水体中非常丰富的噬藻体多样性, 且它们基因组成显著差异。

5 噬藻体遗传多样性的未来研究

噬藻体多样性及其生态作用一直倍受研究人员的高度关注, 尤其是对有害蓝藻水华控制成为水环境科学、病毒学及藻类研究的重要关注方向。近年来, 借助分子生态学的研究手段从分子水平上开展不同水生态环境中噬藻体多样性的研究, 并取得了一定阶段性成果。然而, 噬藻体遗传多样性的研究是以大量的噬藻体遗传信息为基础, 现有微生物分离培养技术不能满足未知噬藻体的分离鉴定, 从而在一定程度上限制了噬藻体多样性。

根据已经取得的研究成果, 结合分子生态学研究手段, 在未来噬藻体生态学研究中, 我们可考虑从以下几个方面研究: 1)进一步优化与改进微生物分离培养技术, 从不同生境中分离出更多的纯系噬藻体, 用于丰富噬藻体及其基因组资源, 并从分子水平、蛋白水平对所得的噬藻体进行生物学与生态学研究; 2)着重于对富营养化水体中噬藻体的分布、丰度及其与蓝藻数量变化之间的相互关系研究, 将噬藻体作为防治有害蓝藻水华的有效生物调控因子加以利用; 3)综合运用现代微生物分子识别技术, 如蛋白质组学、宏基因组学及基因芯片等, 深入发掘海洋及淡水环境中未知噬藻体基因序列, 对噬藻体多样性进行全面研究; 4)将多种研究手段结合起来进行噬藻体多样性研究, 因为任何一种研究方法都有各自的缺点和不足, 多种方法的联合使用可以取长补短, 减少单一分析技术的局限性, 综合各类技术的优势, 使获得的浮游病毒生态学信息更为客观、真实和有效。

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Advances in researches on cyanophage genetic diversity and molecular ecology

GAO Ebin*, DONG Yiming
School of The Environment and Safety Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang212013,China

Cyanophages are important active components of aquatic microbial communities, and are widespread in both marine and freshwater environments. As a key biological agent, cyanophages exercise a great influence on cyanobacterial population structure, diversity, and aquatic ecological environments. The study on cyanophage diversity in aquatic environments will greatly contribute to the exploitation and utilization of cyanophage resources. The aims of this article are to summarize molecular basis and markers of cyanophage genetic diversity research from the viewpoint of molecular ecology, and to describe the basic concept and application of the related research methods. Furthermore, the combination of molecular ecology and cyanophage diversity research enables us to make some future predictions in this field.

cyanophage; auxiliary metabolic genes; genetic diversity; molecular ecology; cyanobacteria

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.02.025

Q938.8

A

1008-8873(2016)02-166-08

2015-09-02;

2015-10-24

国家自然科学基金项目(No. 31200019); 江苏大学高级专业人才启动基金项目(No. 11JDG151); 中国科学院南海海洋研究所开放基金项目(No. LMB131001)

高恶斌(1979—), 男, 江西彭泽人, 博士, 讲师, 主要从事病毒分子生物学研究, E-mail: gaofei7908@126.com