曲古抑菌素A在体细胞核移植中的应用

施　超, 陈国强, 马育芳（. 上海交通大学农业与生物学院, 上海0040；. 上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 上海003）

曲古抑菌素A在体细胞核移植中的应用

施超1,2, 陈国强2, 马育芳1
（1. 上海交通大学农业与生物学院, 上海200240；2. 上海西普尔-必凯实验动物有限公司, 上海201203）

体细胞核移植（SCNT）技术已成功获得多种哺乳动物的克隆后代，但一直以来克隆的成功率都很低，并且存活个体大多表型异常。研究表明，重构胚的重编程不完全是导致克隆动物存活率低下和发育异常的主要原因之一。DNA甲基化、组蛋白乙酰化都是影响重编程的重要因素，曲古抑菌素A（TSA）是链霉素的代谢产物，同时也是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能降低DNA甲基化水平，促进重编程率，进而提高克隆效率。本文对TSA的生物学功能及其在动物SCNT中的应用进行了探究。

曲古抑菌素A（TSA）； 体细胞核移植（SCNT）； 组蛋白乙酰化

曲古抑菌素A（Trichostatin A, TSA），属羟肟酸类，链霉菌代谢产物，最早作为抗真菌药物使用，后发现其为一种组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase, HDAC）抑制剂中，其作用效果是非竞争性可逆的。目前已知TSA可以通过抑制去乙酰化酶的活性从而提高组蛋白乙酰化的程度，促进表观遗传重组［1］。另外，科研人员发现TSA与转录活性有关，它可使染色质结构变松弛，使外源基因的转录子易于与DNA相结合，促进外源基因的表达，这些功能对于提高体细胞核移植（SCNT）的成功率有重大作用，从而可提高克隆动物的成功率。自2006年TSA率先运用于提高小鼠SCNT的成功率以来，科研人员就TSA是否能提高猪、牛、羊的SCNT的成功率进行了广泛的研究。本文就TSA在SCNT中的应用情况进行讨论，为研究人员在SCNT中的进一步的研究和应用提供参考。

1　目前SCNT的进展

SCNT是指将高度分化的体细胞的细胞核移植到去掉细胞核的卵母细胞中，使体细胞核发生重编程并恢复全能性，产生一个新个体的过程。这种胚胎被移植到生殖周期相近的母体之中，可以发育成为正常动物个体。经过核移植而产生的动物，其遗传结构与细胞核供体完全相同。核移植是动物克隆的一种重要手段，是克隆动物成功的关键。虽然已经有很多品种的实验动物成功获得克隆后代，但克隆的成功率仍很低［2］。造成克隆成功率低下的一个重要原因是表观遗传重编程的不彻底，组蛋白作为表观遗传修饰的重要组成部分，可以直接影响克隆胚胎的发育和外源基因的表达。提高组蛋白乙酰化可促进表观遗传重组，继而提高克隆动物的存活率。

2　组蛋白乙酰化作用及TSA的作用

组蛋白乙酰化反应多发生在核心组蛋白N端碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基。组蛋白乙酰化状态由两类酶即组蛋白乙酰基转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和HDAC及其相对活性决定。在HAT的作用下，乙酰辅酶A上的乙酰基被转移到组蛋白N端赖氨酸的ε-氨基上，中和其正电荷，减弱了核小体中碱性赖氨酸与DNA的静电吸引力，削弱了DNA与组蛋白的相互作用，使染色体处于开放状态，有利于转录因子的进入，促进基因的转录［3］。因此，组蛋白的乙酰化修饰在基因的转录调控中起重要作用。染色质特定部位的组蛋白乙酰化状态呈多样性，核小体上有多个位点可供乙酰化，但特定基因部位的组蛋白乙酰化和去乙酰化以一种非随机的位点特异方式进行［4］。

TSA可以特异抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，降低DNA甲基化水平，激活印记基因的表达［5］。组蛋白乙酰化状态与细胞周期、细胞分化及衰老均有关系，TSA可以抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化成正常细胞，同时还能影响胚胎的发育［6］。在SCNT过程中，TSA作用于供体细胞或重构胚或同时作用于供体细胞和重构胚，提高了SCNT的成功率，进一步保证了动物个体克隆的成功。

3　TSA在实验动物上的应用

3.1在小鼠核移植研究中的应用

在小鼠SCNT过程中, 如果增加TSA作用时间至11 h, 能同时提高孤雌胚的囊胚率和SCNT的囊胚率。而单独改变TSA的浓度，在5～50 nmol/L，胚胎的卵裂率和囊胚率差异并没有显著改变［7］。有研究［8］表明，使用5 nmol/L的TSA处理10 h，小鼠细胞核移植时可使小鼠囊胚的发育率从20%提高至75%； 在使用小鼠的尾尖细胞、脾细胞、神经干细胞和胚胎干细胞做供体细胞的SCNT实验中，使用5～50 nmol/L的TSA，作用于供体细胞10 h，结果显示除了对胚胎干细胞有毒害作用外，对其他几种细胞核移植的囊胚发育都有明显的促进作用。由此推断TSA在小鼠SCNT过程中有促进作用。

3.2在猪核移植研究中的应用

研究［9］表明，使用50 nmol/L 的TSA处理供体细胞或者重构胚24 h能同时提高猪胚胎的卵裂率和囊胚率，通过间接荧光免疫检验发现TSA作用于重构胚提高了组蛋白赖氨酸的重编程能力，并引起了转移核子的膨胀，通过提高重构胚的重编程能力，明显提高了猪的核移植成功率。另有研究［10］表明，TSA在作用于猪的重构胚体外培养时，对重构胚的囊胚率也有大幅提高。同时对于重构胚的1-细胞期、2-细胞期和4-细胞期都有诱导细胞凋亡的作用，而在囊胚期凋亡指数却大幅度下降。由此可以推断，TSA诱导早期重构胚的凋亡是为了促进囊胚期胚胎发育率的提高。

在转基因小型猪的研究［11,12］表明，50 nmol/L 的TSA能大幅度提高体外培养胚胎的卵裂率和囊胚率。但是进一步观察囊胚的细胞数量时显示，50 nmol/L组的明显要少于空白组和100 nmol/L组，且差异显著，说明对TSA的作用机制需要做进一步的研究。

3.3在牛核移植研究中的应用

在印度水牛核移植中添加0.3 μmol/L 的TSA并处理供体细胞48 h后，表明TSA促进了重构胚的重编程，同时影响了表观修饰遗传基因位点acH4K8的乙酰化状态，最终表现为水牛胚胎的体外囊胚发育率显著提高［13］； 在体外培养克隆牛胚胎的试验中，50 nmol/L 的TSA作用供体细胞24 h，其mRNA的翻译准确性大大提高，从而提高了克隆牛胚胎的发育完整性。许多实验研究［14,15］表明，TSA不但是强大的表观遗传调制器而且还是调整细胞周期强大的同步器。

3.4在羊核移植研究中的应用

我国科学家杨楠等［16］研究表明，300 nmol/L 的TSA作用绵羊胚胎细胞10 h，能提高绵羊孤雌胚的囊胚率和囊胚细胞数。李向臣等［17］利用流式分选技术分析处理和间接免疫荧光法检测，发现滩羊供体细胞经10 nmol/L的TSA处理24 h后，其克隆胚胎卵裂率和囊胚率明显得到提升，分别达到85.2% 和35.6%。

3.5其他动物研究中的应用

在克隆兔胚胎的研究［18］中，TSA（50 nmol/L）和神经胶质瘤分子（SCP） （250 nmol/L）共同作用克隆兔的胚胎6 h，胚胎发育至桑椹胚和囊胚的概率分别提高到58.6%和49.4%，由此推断TSA和SCP对克隆兔胚胎体外发育有协同作用，能更好地提高克隆兔的胚胎发育。

在异种SCNT体系中，秦祖兴等［19］研究显示，食蟹猴-猪异种SCNT过程中，添加10 nmol/L的TSA并处理重构胚48 h能显著提高异种重构胚的囊胚发育率。

4　展望

综上所述，TSA对于克隆胚胎表观遗传改变有修正作用，但同时也伴随着致畸作用［20］。TSA浓度过低、作用时间过短时，对于克隆胚胎效果不显著；而当TSA浓度过高、作用时间过长时，则将引起克隆胚胎在发育后期出现致畸作用。在SCNT过程中，TSA作用不同种类胚胎的使用浓度及作用时间是不同的： 小鼠胚胎使用量基本控制在5～50 nmol/L, 时间控制在10～20 h，对胚胎发育有促进作用；猪胚胎使用量控制在5～50 nmol/L，时间控制在12～24 h，对胚胎有促进作用； 牛胚胎使用量控制在30～50 nmol/L ，时间控制在24～48 h，对胚胎发育有促进作用；羊胚胎使用量需控制在10～300 nmol/L, 时间控制在10～24 h，对胚胎发育有促进作用。虽然大量的实验数据表明，TSA对克隆动物的重构胚胎发育有促进作用，但诱发这些现象发生的机制还没有完全明了，因此TSA作用机制是目前研究重点，只有明确了解了TSA的作用机制，才能为TSA在克隆动物胚胎发育中的应用奠定坚实基础。

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The Application of Trichostatin Afor Somatic Cell Nuclear Transfer

SHI Chao1,2, CHEN Guo-qiang2, MA Yu-fang1
（1. School of Agriculture and Biology， Shanghai JiaoTong University， Shanghai 200240， China；2. Shanghai SIPPR BK Laboratory Animals Ltd， Shanghai 201203， China）

Somatic cell nuclear transfer （SCNT） technique has been successfully applied to obtain many mammal clonal offspring. But the success rate was always very low and most surviving individuals showed phenotypic abnormalities. Research shows that the incomplete reprogramming of reconstructed embryo is one of the main reasons that causes the low survival rate and offspring dysplasia. DNA methylation and histone acetylation are both the essential factors that influence the reprogramming. Trichostatin A （TSA ）is a streptomycin metabolite, as well the histone acetylation enzyme inhibitor that reduces the level of DNA methylation and promotes the reprogramming rate to improve the cloning efficiency. The article studies the biological function of TSA and its application in animal SCNT.

Trichostatin A （TSA ）； Somatic cell nuclear transfer （SCNT）； Histone acetylation

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0157-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.02.017

2015-06-02

施超（1985-）, 女, 研究方向： 实验动物胚胎学。E-mail： chao85chao@163.com