新生期重复吸入七氟烷的成年大鼠海马组织CA3区Aβ、Tau蛋白表达变化

2016-04-06刘富兵马欢欢徐珊张超朱昭琼

山东医药 2016年27期

关键词：氟烷磷酸化海马

刘富兵，马欢欢，徐珊，张超，朱昭琼

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2贵州省麻醉与器官保护重点实验室)

新生期重复吸入七氟烷的成年大鼠海马组织CA3区Aβ、Tau蛋白表达变化

刘富兵1，马欢欢2，徐珊1，张超2，朱昭琼2

(1遵义医学院附属医院，贵州遵义563000；2贵州省麻醉与器官保护重点实验室)

目的观察新生期重复吸入七氟烷对成年大鼠海马组织CA3区β淀粉样蛋白(Aβ)和异常磷酸化微管相关蛋白(Tau蛋白)的影响。方法取24只新生大鼠，随机分为A、B、C组，每组各8只。分别于出生7、14、21 d时将各组大鼠置于自制麻醉剂箱中，连接麻醉机，A、B、C组分别吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空气)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全苏醒后放回原笼，常规饲养至出生95 d(成年期)备用。出生 95 d检测各组成年大鼠海马组织CA3区Aβ和Tau蛋白。结果出生95 d时A、B、C组海马组织CA3区Aβ蛋白的相对表达量分别为0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相对表达量分别为0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B两组海马组织CA3区Aβ蛋白的相对表达量与C组相比，P均<0.05；B组海马组织CA3区磷酸化Tau蛋白的相对表达量与C组相比，P<0.05。结论新生期重复吸入七氟烷可导致成年大鼠海马组织CA3区Aβ和Tau蛋白表达升高。

七氟醚；成年，大鼠；海马；CA3区；β淀粉样蛋白；微管相关蛋白

目前，出生缺陷发病率逐年升高，外科手术是常用的治疗方法。间断、重复接受全身麻醉是否影响患儿成年后的学习记忆能力目前临床尚无定论。β淀粉样蛋白(Aβ)是大脑皮质老年斑的主要成分，微管相关蛋白(Tau蛋白)是Tau家族的主要成员,研究发现，Aβ和Tau蛋白是引起学习记忆能力下降的重要物质[1,2]。七氟烷是目前临床常用的吸入麻醉药，已广泛用于婴幼儿外科手术麻醉[3,4]。目前婴幼儿期重复吸入七氟烷是否影响患者成年后记忆能力的报道较少。2013年7月～2015年1月，我们观察了新生期重复吸入七氟烷的成年大鼠海马组织CA3区Aβ和磷酸化Tau蛋白的表达情况，现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物、药物、试剂与仪器SPF级SD孕鼠30只由重庆第三军医大学实验动物中心提供(许可证号：SCXK(渝)2007-0005),体质量300～400 g。待孕鼠自然分娩后选取7日龄大鼠24只，母乳喂养28 d。(动物饲养环境：相对温度：50%～65%，环境温度21℃±2℃，自然昼夜循环光照。七氟烷购自鲁南贝特制药有限公司，Aβ抗体、磷酸化Tau蛋白抗体购自英国Abcam公司，GTVIsionⅢ鼠/兔通用二抗检测系统、气体监测仪购自德国Dragra公司，循环密闭吸入麻醉剂箱(78 cm×48 cm×15 cm)为本实验室自制，箱底铺约2 cm钠石灰后覆盖薄层纱布，显微镜荧光图像分析系统购自德国Leica公司。

1.2大鼠分组及其新生期七氟烷吸入、饲养方法取24只新生大鼠，随机分为A、B、C组，每组各8只。分别于出生7、14、21 d时将各组大鼠置于自制麻醉剂箱中，连接麻醉机，A、B、C组分别吸入2.6%七氟烷、1.5%七氟烷、(1 L O2+l L空气)/min，每次1 h，1次/d。待大鼠完全苏醒后放回原笼，常规饲养至出生95 d(成年期)备用。

1.3各组成年大鼠海马组织CA3区Aβ、异常磷酸化Tau蛋白检测采用免疫组织化学法。分别于出生 95 d时取各组大鼠，1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛经主动脉行脑灌注，断头处死大鼠后取出海马组织，石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、酒精梯度复水、微波抗原修复、BsA封闭30 min后加入Aβ(1∶400)、磷酸化Tau蛋白抗体(1∶400)。4 ℃孵育过夜、复温、生物素标记二抗、DAB显色，苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。海马组织染色后细胞核呈紫蓝色，Tau蛋白、Aβ蛋白表达于海马细胞胞质内。每区随机取4个视野，应用Image-Pro Plus分析系统分析各组海马CA3区Aβ、异常磷酸化Tau蛋白的光密度(MOD)值，以MOD值代表蛋白的相对表达量，实验重复3次，取平均值。

2　结果

出生95 d时A、B、C组海马组织CA3区Aβ蛋白的相对表达量分别为0.431±0.092、0.417±0.097、0.334±0.100，磷酸化Tau蛋白的相对表达量分别为0.434±0.055、0.456±0.059、0.410±0.060。A、B两组海马组织CA3区Aβ蛋白的相对表达量与C组相比，P均<0.05；B组海马组织CA3区磷酸化Tau蛋白的相对表达量与C组相比，P<0.05。

3　讨论

七氟烷是新型吸入全麻药，麻醉诱导快，且患者呼吸暂停发生率低、血流动力学也更为稳定[5]。七氟烷可增强中枢神经系统内抑制性神经递质GABA受体的效能，从而抑制维持觉醒的关键大脑核团的活性，最终导致意识消失[6,7]。

海马是参与学习记忆和条件反射形成过程的重要部位。海马沿锥体细胞系统分为四个区：CA1、CA2、CA3和CA4。CA1区和下托相连，含有小锥体神经元；CA3区是海马水平部的背外侧部分和垂直部的前内侧部，含有苔藓纤维和轴突[8]。海马与学习记忆相关的两个回路即Papez回路与三突触回路[9]。三突触回路中海马CA1区与CA3区被认为与空间辨别性学习记忆活动的关系甚为密切[10]。有研究者选择性的破坏小鼠海马苔藓纤维突触与CA3区的锥体神经元的联结区，破坏其信息位势的分布格局，使保存在海马神经网络中的记忆信息很快消失，从而证实，海马神经元的突触与CA3区联结是否正常，与学习记忆密切相关[12]。CA3区锥体细胞与门区神经元一样，也是海马致癫的易损细胞，锥体细胞死之后，苔藓纤维的正常投射靶区消失，以致苔藓纤维侧支发芽至齿状回内分子层。接着，CA3区锥体细胞将信息通过Schaffer侧支突触传给CA1区，CA1区被认为是海马的主要输出区域。

MOD是通过比较光密度来反映阳性细胞所表达的蛋白的强度，其原理是根据细胞内不同化学成分的染色反应具有不同的吸收波长，并且化学反应在吸收值和细胞化学含量间存在一定的化学剂量关系的特点，衡量组织或细胞中某种成分的含量。TPA是以阳性反应的光密度值为设定条件，测定阳性染色面积为参数，通过比较阳性细胞所表达的面积比来实现的，分析阳性细胞蛋白表达的量的差异。这样将阳性反应的强度与量结合，避免了平均光密度主观性强，更客观的分析测定。

研究表明，吸入麻醉药可引起大脑内海马皮层Tau蛋白过度磷酸化和β淀粉样蛋白聚集，其病理改变在海马形成老年斑(SP)和大量的神经原纤维缠结(NFTs)，并伴随大量神经丧失，从而导致学习和记忆功能障碍[12]。β淀粉样蛋白存在于正常大脑中，是一个产生、降解和清除的平衡过程。正常生理条件下，淀粉样前体蛋白(APP)经非Aβ生成途径代谢。新生期SD大鼠，在间断、重复吸入临床麻醉浓度与亚麻醉浓度七氟烷后，在病理状态下，APP的非Aβ源加工途径受抑制，Aβ途径被激活，导致Aβ的生成过多及Aβ的降解和清除受抑制，最终导致Aβ的积聚，形成SP[13,14]。故吸入临床麻醉浓度与亚麻醉浓度的七氟烷在CA3区的β淀粉样蛋白聚积。由于APP基因具有突变或多态性，突变对细胞凋亡的发生起着重要作用，其中聚集性Aβ对神经细胞的毒性更大，并且可通过Aβ对神经元的直接作用而引起细胞的损伤。因此，Aβ具有很强的聚集性,易形成极难溶解的沉淀。所以推测在吸入临床麻醉(2.6%)浓度的七氟烷在CA3区的β淀粉样蛋白聚积，进而影响其学习记忆能力。Tau蛋白是含磷酸基的微管相关蛋白，正常情况Tau蛋白以磷酸化和去磷酸化两种形式存在，处于一个平衡状态，正常成熟脑中含2～3个磷酸基，在微管组装中起着重要的作用，有利于正常成熟神经元轴突的完整性和稳定性；过度异常化的Tau蛋白含5～9个磷酸基，其引起主要病理改变为：Tau蛋白变得异常磷酸化，采用非正常构象，在神经元中重新分布组合成不溶性、不能与微管结合的双螺旋细丝(PHFs)，进而聚集成神经原纤维缠结(NFTs)。由于神经元纤维缠结的形成,破坏了神经元的正常物质转运功能,进而阻断神经元之间的突触传递,最终导致神经元的损伤及死亡。相关研究发现[15]，小鼠海马CA3 区锥体细胞NR1 亚基基因敲除后削弱了联想回忆的能力,推测CA3区与联想记忆有关(自联想与异联想)。本实验吸入临床麻醉浓度七氟烷后，CA3区Tau蛋白与对照组无异常，推测吸入临床麻醉浓度的七氟烷并不影响自联想与异联想记忆。

综上所述，新生期重复吸入七氟烷可导致成年大鼠海马组织CA3区Aβ和Tau蛋白表达升高。提示在临床上应避免对存在存在出生缺陷需重复进行外科手术的患儿重复采用七氟醚麻醉。

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