体外心肌细胞缺氧／复氧模型损伤及参元丹干预的影响

杨志海 佟 彤 刘红旭 尚菊菊 邢文龙 李 享（首都医科大学附属北京中医医院心血管科，北京，100010）



体外心肌细胞缺氧／复氧模型损伤及参元丹干预的影响

杨志海 佟 彤 刘红旭 尚菊菊 邢文龙 李 享
（首都医科大学附属北京中医医院心血管科，北京，100010）

摘要目的：建立体外培养乳鼠心肌细胞缺氧／复氧模型，观察益气逐瘀组方参元丹（SYD）对模型心肌细胞存活率和细胞损伤程度的影响，以进一步探讨其改善冠心病围手术期心肌损伤的作用机制。方法：体外培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，建立缺氧复氧细胞模型并予分组处理，CCK法检测心肌细胞存活率，酶法检测各组细胞培养上清液中磷酸肌酸激酶（CPK）、乳酸脱氢酶（LDH）的含量。结果：模型组存活率低于正常组（P＜0. 05），而CPK、LDH释放量高于正常组（P＜0. 05）；SYD含药血清组、PDTC＋SYD组以及PDTC＋空白血清组细胞存活率均高于模型组和空白血清组（P＜0. 05），细胞酶释放量均低于模型组和空白血清组（P＜0. 05），此3组间的数据比较，差异不具有统计学意义。结论：参元丹能够提高心肌细胞缺氧／复氧损伤模型的细胞存活率，降低细胞损伤程度；其机制可能通过抑制核因子NF-κB及其介导的氧化应激和炎性反应降低细胞损伤；提示参元丹可能具有围手术期心肌损伤的保护作用。

关键词冠心病；围手术期心肌损伤；体外细胞模型；参元丹；NF-κB通路

The Effect of Shen Yuan Dan on the Vitro Myocardial Model Cells with Hypoxia／reoxygenation Injury

Yang Zhihai，Tong Tong，Liu Hongxu，Shang Juju，Xing Wenlong，Li Ting
（Department of Cardiology，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine affiliated to Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective：Culturing the neonatal rat myocardial cells'hypoxia／reoxygenation modle in vitro and observe the effects of Yiqi Zhuyu Formula（Shenyuandan，SYD）on the survival rate and the degree of myocardium cells injury biomarkers，and thus to further discuss the its relieving mechanism on PMI. Methods：Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro to establish the hypoxia／reoxygenation model. Then use CCK-8 assay to detect the survival rate and enzymatic assay to detect the levels of CPK and LDH on each cell culture supernatant. Results：Compared with the normal group，the survival rate of the model group is lower （P＜0. 05）and the CPK and LDH release quantity is higher（P＜0. 05）. The survival rate of SYD drug-containing serum group，PDTC＋SYD and PDTC＋blank serum group were higher than those of model group and blank group（P＜0. 05）；serum cell enzyme（CPK，LDH）release quantity are lower than those of the model group and blank serum group（P＜0. 05），while there was no statistical difference among the three groups. Conclusion：Shen Yuan Dan can improve the cell survival rate of myocardial cell hypoxia／reoxygenation injury model and relieve cell injury. This may because it can reduce cell damage through inhibiting NF-κB and its mediated oxidative stress and inflammatory response. It indicates that Shen Yuan Dan could protect myocardium cells.

Key Words CHD；PMI；In vitro cell model；SYD；NF-κB pathway

冠状动脉介入治疗（Percutaneous Coronary Intervention，PCI）已经成为冠心病最重要的治疗方法并越来越广泛的应用于临床。围手术期心肌损伤（PMI）是PCI常见并发症。本研究在前期研究的基础上，通过建立体外心肌缺氧／复氧细胞损伤模型，观察中医药制剂SYD含药血清干预对心肌细胞存活率及损伤程度的影响，并初步探讨SYD通过抑制核因子NF-κB介导的信号通路发挥心肌保护作用的分子机制，以期进一步探讨其改善冠心病围手术期心肌损伤的作用机制。

1　材料

1. 1 实验动物 SD大鼠40只，SPF级，雄性，体重（200±20）g，购于中国医学科学院实验动物研究所。（许可证编号：SCXK（京）2009-0007）；新生Wistar大鼠（1～3 d），雌雄不限，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。（实验动物许可证号：SCXK（京）2006-0009）

1. 2 药物与试剂 参元丹（参元益气活血胶囊，院内制剂，99京卫制字［056］第F-2037号）。将参元丹除去包衣，称重溶于蒸馏水中，以10倍量蒸馏水煮提3次，每次30 min，合并煮提液，浓缩至含生药0. 048 g／mL的药液备用；

Ⅱ型胶原酶（CollagenaseⅡ），Sigma；胰蛋白酶（Trypsin），Ameresco；DMEM／F12混合培养基（Dulbeeeo's Modified Eagle Medium／Nutrient Mixture F-12Ham），Hyclone；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS），Gibco（特级）；PBS平衡盐溶液，Sigma；5-溴脱氧尿嘧啶（5-Bromo-2'-Deoxyuridind，Brd-u），Sigma；吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC），Sigma；无糖Earle's液，M＆C Gene Technology；青霉素-链霉素混合液（10 000 U／mL），中国医学科学院医学工程研究所；细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8），DOJINDO；肌酸磷酸激酶（CPK）ELISA试剂盒，Rapidbio（RB）；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，南京建成生物工程研究所；95%N2＋5%CO2混合气体，由北京中医医院氧气站提供。

1. 3 仪器 CO2／O2三气培养箱（美国Thermo Scientific，3131）；超净台（再鑫，CLASS100）；高压蒸气灭菌系统（日本SANYO，MLS-3750）；电热恒温鼓风干燥箱（重庆万达公司，CS101-1FB）；低温高速离心机（德国Sigma，3-18K）；电子分析天平（德国，AE200）；激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS，FV1000）；生物分光光度计（德国Eppendof，AG22331）

2　方法

2. 1 含药血清的制备 将50只大鼠随机分为给药组和空白组，每组25只。给药组给予参元丹0. 048 g／mL、10 mL／kg，空白组给予等量生理盐水，连续给药5 d，2次／d，最后一次给药后1 h对大鼠进行腹腔麻醉，腹主动脉取血，静置2 h后，3 000 r／min离心10 min，无菌条件下分离血清，将SYD含药血清和空白血清2组血清分别合并混匀，56℃，30 min灭活，4 mL分装，封口膜密封，-80℃保存备用。

2. 2 原代心肌细胞培养 将出生1～3 d的Wistar大鼠固定于泡沫板上，75%乙醇常规消毒乳鼠胸腹部皮肤。超净台内沿乳鼠第3、4肋间眼科剪打开胸腔，眼科镊取出心脏，至于盛有预冷PBS培养皿中。剪掉大血管等非心肌组织，反复清洗4次，将心脏剪成1 mm3大小的组织块，加入5倍于组织体积的胰酶、胶原酶混合消化液（1∶1比例，胰酶以PBS液配制终浓度为0. 08%，胶原酶以DMEM／F12培养液配制，终浓度为0. 08%），于37℃消化，消化完毕后轻轻吹打组织块，重复消化步骤，收集除第一次以外的细胞悬液至15 mL离心管中，加入等量的含胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化，4℃、800 r／min离心10 min，弃去上清，轻柔吹打成单细胞悬液。过200目筛网，差速贴壁分离法纯化心肌细胞（90 min）。加入Brd-U抑制成纤维细胞生长，以5×105密度种板。细胞于37℃、5%CO2、饱和湿度环境培养，48 h换液后开始正式实验。

2. 3 细胞造模及分组给药 正常培养48 h的心肌细胞，用DMEM／F12培养基同步化，24 h后进入造模及分组实验：先弃去培养液，PBS洗3遍，加入预先以95%N2＋5%CO2混合气饱和15 min的无糖Ear1e'S液：1）模型组：三气培养箱低氧模式（1%O2、5%CO2，下同）中缺氧培养2 h后，用氧气饱和的DMEM／F12换液后正常培养4 h；2）SYD含药血清组：缺氧培养2 h后，加入10%SYD含药血清继续正常培养4 h；3）空白血清组：缺氧培养2 h后，加入10%空白血清继续正常培养4 h；4）NF-κB抑制剂PDTC＋SYD含药血清组：缺氧培养2 h后，加入终浓度为10-4mol／L的PDTC和10%SYD含药血清继续正常培养4 h；5）NF-κB抑制剂PDTC＋空白血清组：缺氧培养2 h后，加入终浓度为10-4mol／L的PDTC和10%空白血清继续正常培养4 h；6）正常对照组：不做任何处理，加入培养基正常培养6 h。

2. 4 细胞存活率测定及细胞培养液中LDH、CPK含量测定 各组细胞经造模给药后，严格按照试剂盒说明书步骤进行加样操作，用分光光度计测得各组OD值。

酶活性计算公式：

3　结果

3. 1 各组心肌细胞存活率的影响 模型组OD值明显低于正常组（P＜0. 05），而与空白血清组比较未见明显差异（P＞0. 05）；SYD含药血清组、PDTC ＋SYD、PDTC＋空白血清组均高于模型组和空白血清组（P＜0. 05）。SYD含药血清组与PDTC＋SYD 2组均能明显提高OD值，后者略高于前者，但组间比较没有统计学意义（P＞0. 05）；SYD组略高于PDTC＋空白血清组，但差异无统计学意义（P＞0. 05）。见表1。

表1　各组细胞存活率±s，n＝6）

表1　各组细胞存活率±s，n＝6）

注：与正常组对比，＃P＜0. 05；与模型组相比，*P＜0. 05；与空白血清组相比，△P＜0. 05。

组别　　样本（n）　　存活率（OD值）正常对照组60. 46±0. 03模型组　6　0. 24±0. 05＃SYD含药血清组　6　0. 37±0. 06*△空白血清组　6　0. 26±0. 04 PDTC＋SYD含药血清组　6　0. 41±0. 07*△PDTC＋空白血清组　6　0. 34±0. 04*△

3. 2 各组细胞上清液CPK、LDH水平 与正常组对比，模型组在缺氧复氧过程中产生明显的细胞损伤（P＜0. 05），空白血清组未见明显的改善损伤作用（P＞0. 05）；而SYD含药血清组、PDTC＋SYD、PDTC＋空白血清组的药物干预均能不同程度改善细胞损伤（P＜0. 05），但3组间差异无统计学意义（P＞0. 05）。见表2。

表2　各组细胞培养液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

表2　各组细胞培养液中CPK、LDH水平（±s，n＝6）

注：与正常组对比，＃P＜0. 05；与模型组相比，*P＜0. 05；与空白血清组相比，△P＜0. 05。

组别　　样本（n）CPK （U／L）LDH （U／L）6　 162. 2±16. 9　 188. 4±18. 8模型组　6　 332. 4±22. 3＃　412. 6±24. 6＃SYD含药血清组　6　 198. 8±19. 8*△277. 4±28. 3*△空白血清组　6　 275. 3±25. 4　 388. 5±22. 7 PDTC＋SYD含药血清组　6　 177. 6±27. 6*△231. 6±38. 8*△PDTC＋空白血清组　6　 203. 1±20. 9*△278. 3±26. 6正常对照组*△

4　讨论

在PMI发生的机制研究中［1-3］，无论是手术操作过程引起的微小血管闭塞、痉挛造成的心肌缺血缺氧，或是缺氧／复氧、缺血再灌注过程引起的氧化应激、钙超载、炎性反应，均会造成心肌细胞的损伤、代谢和结构的破坏，并引起细胞最终的坏死和凋亡。心肌细胞损伤后，细胞内的蛋白和各种酶类由于细胞功能结构的改变而释放到细胞外，其中CPK、LDH以及他们的同工酶对于心肌损伤的判断具有较高的灵敏度和特异性。

中医药在改善动脉粥样硬化血管内皮功能、减轻过氧化损伤、抑制炎性反应、减轻心肌缺血再灌注损伤等方面的功能已经得到证实。首都医科大学附属北京中医医院心血管科刘红旭主任医师基于冠心病心绞痛“气虚血瘀”的病理特点而制成的具有“益气逐瘀”功效的院内制剂——参元丹，临床上对不稳定心绞痛具有良好疗效。我们前期的研究结果表明［4-9］，参元丹具有改善心肌缺血、减轻缺血再灌注损伤及促进内源性心肌保护作用，提示在PMI中可能发挥心肌保护作用。

核因子-κB（NF-κB）是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子上一段10bp的核苷酸序列特异结合的核蛋白。通常情况下它们都是以二聚体形式和其抑制蛋白IκB结合在一起，存在于胞浆中，在受到诸如缺血缺氧、机械损伤、病毒感染、放射线照射等应激条件下，NF-κB被激活，进而启动相关靶基因的转录，参与炎性反应、免疫反应、细胞凋亡等病理生理过程。研究表明，机体氧化应激与NF-κB激活密切相关，氧化应激过程中活性氧（ROS）大量增加，通过促进具有κB结合位点的炎性反应因子（如IL-6、IL-8、TNF-α等）的表达参与NF-κB激活过程［10］。因此，氧化应激可能作为始动因素，激活NF-κB介导的炎性反应通路，参与了PCI后PMI发生发展的全过程。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（Pyrrolidine Dithiocarbamate，PDTC）为二硫氨基酸酯，具有抗氧化及金属螯合作用，可以特异性抑制NF-κB活性，有效抑制氧化应激所致的NF-κB的过度表达，可阻止细胞因子诱导炎性反应递质基因表达。王云等［11］研究也表明，使用NF-κB激活抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）可使心肌NF-κB活性明显降低，减轻白细胞粘附和浸润，缺血再灌注损伤显著减轻。

综上所述，抑制PCI造成的过氧化损伤和炎性反应，调节NF-KB通路的活性可能是减轻PCI后PMI损伤的重要途径。因此，本实验设计通过SYD 和PDTC干预，检测缺氧／复氧过程引起细胞损伤后细胞的存活率和CPK、LDH释放量，来初步探讨中医药制剂对心肌保护的作用机制。

CCK-8法以其高灵敏度、低细胞毒性、方便快捷的特点广泛应用于细胞增殖-毒性检测试验。CPK 和LDH作为较稳定的细胞酶，其释放水平的高低可以反映细胞损伤程度的高低。本研究中SYD含药血清组、PDTC＋SYD组以及PDTC＋空白血清组细胞存活率均高于模型组和空白血清组，细胞酶释放量均低于模型组和空白血清组，且结果均具有统计学意义，表明参元丹能够改善损伤后的细胞状况，降低细胞结构的破坏程度。此3组间的数据比较，差异不具有统计学意义，但SYD的干预效果略高于PDTC＋空白血清，且SYD和PDTC两者联合干预效果更好，提示SYD可能具有调控细胞缺氧／复氧过程中氧化应激和炎性反应的作用，而这种作用可能与调节NF-κB通路的活性有关，后期实验可以进一步研究核因子NF-KB相关调控因子的基因和蛋白表达情况，以更深层次探讨SYD在发挥围手术期心肌保护作用方面的分子机制。

5　结论

参元丹能够提高心肌细胞缺氧／复氧损伤模型的细胞存活率，降低细胞损伤程度；其机制可能通过抑制核因子NF-κB及其介导的氧化应激炎性反应信号通路降低细胞损伤；提示参元丹可能具有围手术期心肌损伤的保护作用。

参考文献

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（2016 -02 -24收稿 责任编辑：洪志强）

中图分类号：R256. 22

文献标识码：A

doi：10. 3969／j. issn. 1673 -7202. 2016. 03. 007

通信作者：刘红旭，男，现任首都医科大学附属北京中医医院心血管科主任，主任医师，教授，博士研究生导师，邮编：100010，Tel：（010）52176633

基金项目：国家自然科学基金面上项目（编号：81273741）；北京市科委十病十药项目（编号：Z141100002214010）；北京市教委科技发展计划面上项目（编号：KM201310025027）