尿足细胞相关标记物在糖尿病肾病领域的研究进展

黄山珊，沈清

(重庆医科大学附属第一医院，重庆 400000)



尿足细胞相关标记物在糖尿病肾病领域的研究进展

黄山珊，沈清

(重庆医科大学附属第一医院，重庆 400000)

摘要：足细胞是一种高度特异性终末分化细胞，其损伤与糖尿病肾病(DN)进展密切相关，尿足细胞相关标记物检测有望成为一项DN早期诊断的无创伤性指标。尿液中完整足细胞以及足细胞碎片的定量主要是通过标记足细胞特异蛋白、mRNA及mi-RNA，其检出的阳性率及准确性有赖于各种定量方法的完善。探寻一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前尿足细胞标记物检测应用于DN早期临床诊断所亟待解决的问题。本文重点介绍了尿足细胞相关标志蛋白、mRNA、mi-RNA及胞外体等在该研究领域的新进展，并分析目前存在的问题及发展前景。

关键词：足细胞；生物学标记；尿；糖尿病肾病；诊断

世界范围内糖尿病肾病(DN)的发病率在不断增加，已成为发达国家终末期肾脏病(ESRD)的首要原因，约占我国ESRD病因的16.4%。临床用于评价肾脏损伤的指标如尿蛋白、血清肌酐、微球蛋白、尿微量白蛋白等都有各自的局限性，几乎没有标志物可以准确预测其进程。近年来研究显示，尿液足细胞相关标志蛋白、足细胞mRNA、足细胞mi-RNA、胞外体等可能为临床治疗、预测DN进展及预后提供一个新的无创伤的指标。本文就尿液足细胞相关标记物检测在DN领域的研究进展作一综述。

1足细胞的生物学特点及DN足细胞损伤的机制

1.1足细胞的生物学特点足细胞又称肾小球脏层上皮细胞，是一种高度特异性终末分化细胞，与内皮细胞、肾小球基底膜(GBM)共同构成肾小球滤过

屏障，维持正常的肾小球滤过功能。正常足细胞由细胞体、主足突及次级足突组成。足突由基底部、顶部及SD三部分组成，这三部分特异表达的蛋白分子和以肌动蛋白为主的细胞骨架系统相互协同作用，保证了足细胞结构和功能的稳定[1]。基底膜区蛋白分子如α3β1整合素、整合素链接酶，它们将足细胞锚定在GBM肾小球基底膜上，在维持足突正确位置、保证滤过膜完整性方面发挥重要作用；顶膜区蛋白分子主要有podocalyxin和podoplanin。podocalyxin是一种带负电荷的小球唾液黏蛋白，是组成GBM电荷屏障的主要物质。podoplanin是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，目前推测podoplanin的表达异常与足突融合有关；裂孔膜蛋白分子包括nephrin、podocin、CD2AP、NEPH1、densin、P-cadherin、ZO-1、FAT等，其中较关键的SD分子有nephrin、podocin、CD2AP，它们共同稳定裂孔隔膜完整性，同时作为足细胞裂孔隔膜分子与骨架蛋白相互链接，共同参与足细胞的黏附、信号传导、吞噬等生理活动；细胞骨架蛋白主要包括actin、α-actinin-4和synaptopodin，起桥梁作用分别连接基底膜的整合素和裂孔膜蛋白，对维持足细胞正常形态功能起重要作用[2]。

任何影响足细胞相关结构蛋白的病理刺激都可导致足细胞正常骨架结构的改变，如果足突能再次形成指状突起结构，肌动蛋白细胞骨架得以修复，早期的足细胞损伤是可逆的。但足细胞长期持续损伤会使足突融合消失、空泡及假囊肿形成，足细胞发育停止、去分化及细胞凋亡，刺激壁层上皮细胞增殖，肾小球基底膜皱缩，毛细血管损失，进一步导致球性硬化；同时足细胞与基底膜相互作用减弱，铆钉于肾小球基底膜的足细胞松动，甚至从基底膜剥离、脱落，残存足细胞代偿性工作，最终失代偿，造成不可逆的细胞丢失，引起滤过膜机械及电荷屏障功能异常，蛋白漏出，因此足细胞损伤常导致临床出现蛋白尿[3,4]。

1.2DN足细胞损伤机制随着近年对足细胞损伤机制的进一步研究发现，DN中足细胞损伤不是单由某个因素所诱发，而是多个因素的联合作用所致[5]。损伤机制主要包括：①血管紧张素Ⅱ通过破坏裂孔隔膜结构和功能、诱导足细胞凋亡等多种途径引起足细胞损伤；②高糖诱导氧化和抗氧化的失衡及氧自由基产生过多引起足细胞氧化应激及细胞凋亡；③高糖增强TRPC6(新近发现的足细胞裂孔膜蛋白之一)启动子活性，激活TRPC6通道，引起细胞氧化应激和钙超载导致足细胞损伤；④TGF-β1细胞因子诱导的足细胞变性增殖，降低足细胞的运动性，最终导致肾小球纤维化；⑤胰岛素抵抗(IR)促使葡糖糖在足细胞的转运和吸收障碍，加剧足细胞损伤；⑥参与维持足细胞结构与功能的相关miRNA异常表达，打破足细胞骨架结构及内环境稳态；⑦细胞骨架相关蛋白破坏改变足细胞动力学，促进足细胞损伤。

DN状态下足细胞损伤与蛋白尿的发生和发展密切相关，临床上DN早期表现为肾小球高滤过状态，续之出现尿微量白蛋白，尿中白蛋白量逐渐增高进入临床肾病期，最后发展为终末期肾病。在DN各期中均伴肾小球足细胞数目及密度的减少，Dalla等[6]发现2型糖尿病患者在DN早期就已出现足细胞的密度降低和结构变化，并且与蛋白尿的增加有关。 Nakamura等[7]证实，显性蛋白尿期CKD患者尿足细胞检出阳性率高于微量白蛋白尿期CKD患者，且前者尿足细胞数高于后者。可见随着DN临床进展，肾小球足细胞损伤脱落、数目减少，尿足细胞检出率升高；尿足细胞是DN疾病活动的标志物。

2与DN相关的尿足细胞标记物

2.1尿足细胞标志蛋白①podocalyxin：podocalyxin是足细胞计数中最常用的标记物。尿液podocalyxin可通过多种方法检测，包括间接免疫荧光法、免疫比浊法、ELISA法和流式细胞仪等[8]。Hara等[9]采用免疫荧光法检测肾脏组织及尿液中podocalyxin分布表达，发现尿液中增加的podocalyxin来源于足细胞顶膜区，而非脱落的足细胞碎片，表明尿液中podocalyxin早于足细胞及其碎片的脱落，尿液中podocalyxin水平增加出现在肾脏损伤早期。Hara等[10]检测了142例肾小球疾病和71例2型DN患者尿液中的podocalyxin，并设立69例健康患者作为对照，结果DN患者尿液podocalyxin水平高于对照组，且早于尿微量白蛋白的出现；同时尿液podocalyxin水平与血清HbA1C、尿白蛋白水平呈正相关，但与血清肌酐、肾小球虑过率水平无明显关系。这更好地解释了DN患者存在高糖诱导足细胞损伤机制，其血清肌酐、肾小球虑过率在正常范围内时已出现肾实质的早期损伤；该研究还发现尿液podocalyxin水平与肾小管标记物β2微球蛋白、α1微球蛋白、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶水平呈正相关。De Nicola等[11]研究表明，DN患者肾小管损伤早于肾小球损伤，联合检测肾小球与肾小管标记物能提高DN早期肾损伤检出的准确性。②nephrin：nephrin主要分布在足细胞裂孔隔膜区，nephrin、podocin和CD2AP相互作用构成裂孔隔膜的功能单位。采用Western blotting法在健康人尿液中无法检测到nephrin[12]。Jim等[13]研究证实，伴有微量至大量尿白蛋白的DN患者尿液nephrin检出率为100%，而尿白蛋白阴性者检出率为54%，且尿液nephrin与尿白蛋白/肌酐值、尿白蛋白呈正相关，与肾小球虑过率呈负相关。nephrin可能是糖尿病早期发展为DN的早期预测指标，监测尿液中nephrin蛋白可能为DN的早期诊断提供新的途径。③podocin：podocin与nephrin共同维持SD结构与功能完整，二者密切相关，目前多采用肾脏组织podocin蛋白及其mRNA标记足细胞，而尿液中的podocin在DN早期诊断方面的研究鲜有报道。

podocalyxin还分布于肾脏的内皮细胞和壁层上皮细胞，并不仅限于足细胞。研究发现，乳腺癌、前列腺癌等肿瘤的发生与podocalyxin异常表达有关[14]；既往研究认为，nephrin仅表达于肾组织，目前仍有争议[15]。尽管相关标志蛋白已成为最常用的尿足细胞标志物，但肾小球疾病本身会对这些蛋白的表达及分泌造成怎样的影响，这些蛋白在肾单位及泌尿系统会有哪些病理生理变化还有待研究。有研究[16]指出，健康人尿液中也可检出足细胞；故尿足细胞标志蛋白来源于脱落的足细胞或足细胞碎片还是正常凋亡足细胞，还有待区别。

2.2尿足细胞标志mRNAs与足细胞标志蛋白相比，足细胞特异性mRNAs(采用PCR法检测)更易定量，具有更高的敏感性和特异性。Sato等[17]通过大鼠模型及患者尿液检测肾小球疾病状态下尿足细胞mRNAs，认为尿液足细胞mRNAs可望成为肾小球疾病诊断及监测的有力指标。有学者进一步用实时PCR方法检测了不同发病阶段DN患者尿synaptopodin、podocalyxin、CD2-AP、α-actin4和podocin相关mRNA表达，结果发现随疾病进展，DKD患者尿液中以上相关分子mRNA表达增加，而且与估计的肾小球滤过率呈负相关，该作者也认为尿中足细胞相关分子是DN的标记物[18]。Lioudaki等[19]研究发现，相比非糖尿病患者，2型糖尿病患者尿nephrin及podocin相关mRNA水平明显增高，而synaptopodin相关mRNA水平无明显差别。该研究还证实尿液nephrin mRNA与podocin mRNA水平有明显相关性，且在尿白蛋白阴性糖尿病患者二者已有显著增高，尿nephrin mRNA与podocin mRNA可望成为DN患者早期肾脏损伤监测指标。随慢性肾脏病的进展，相比肾实质及尿液中podocin mRNA水平，nephrin mRNA表达有下调趋势。根据这一特性，Fukuda等[20]采用尿PNR(podocin/nephrin mRNA值)预测慢性肾脏病进展，相比传统指标，如24 h尿蛋白定量、尿蛋白/肌酐值，PNR与肾脏病理组织分期有良好的相关性。这些研究均说明足细胞相关尿mRNA可作为DN严重程度分级的新的评价指标。

2.3尿足细胞标志mi-RNA血清或尿液足细胞mi-RNAs的异常表达与DN密切相关，在DN尚未出现明显症状，或尿蛋白水平发生异常改变之前，血清或尿足细胞mi-RNAs的异常图谱可能就已出现。尿足细胞mi-RNAs水平对判断DN的进展分级及预后有潜在的生物学标志意义。Li等[21]通过体外足细胞培养模拟DN压力应激实验，运用mi-RNA微阵列分析发现在压力应激导致足细胞黏附能力损伤时miR-124高表达，螺内酯治疗后表达降低，该研究提示miR-124可作为DN潜在性标志物。此外，Liu等[22]通过实时定量荧光PCR检测尿miR-126发现，与非DN患者相比，2型DN患者尿miR-126的水平显著升高。经治疗后，多数DN患者尿miR-126水平显著降低。这项研究提示，尿miR-126可作为DN有效的预测标志物。Szeto等[23]研究提示，DN患者尿沉渣中miR-21表达量与肾小球滤过率呈正相关，尿沉渣中有高含量miR-21的患者血透生存期较长。由此猜测，高表达的miR-21或许是DN的保护因素。mi-RNA在尿液中表达较稳定，有望成为DN的生物标记物；但尿液mi-RNAs的表达量较低，尿液中提取mi-RNAs的过程复杂，尿足细胞特异性mi-RNA作为DN早期诊断性标志物的报道甚少，还有待进一步的实验研究。

2.4尿足细胞细胞外囊泡EVsEVs是由泌尿系统各种细胞包括足细胞、肾小管上皮细胞及泌尿道上皮细胞等释放的膜性球形小体，其内部和表面可携带多种信息传递因子，如膜蛋白、胞质蛋白及核蛋白[24,25]。Zubiri等[26]通过比较健康正常人群及DN患者尿uEVs，发现了254种不同蛋白质。研究显示，足细胞相关尿EVs水平对DN的进展分级及预后有潜在的生物标志学意义。Kalani等[27]采用差数离心方法分离48例Ⅰ型糖尿病患者和25例健康对照者尿胞外体WT-1蛋白，发现伴蛋白尿的糖尿病患者尿胞外体WT-1蛋白水平明显高于无蛋白尿的糖尿病患者，且后者中仅半数患者尿胞外体WT-1蛋白阳性。该研究还发现，DN患者尿胞外体WT-1蛋白水平与尿蛋白/肌酐值、尿白蛋白/肌酐值及血清肌酐呈正相关，DN患者尿胞外体WT-1蛋白水平随肾功能损害加重而增加。提示尿WT-1蛋白可反映DN患者足细胞早期损伤。Barutta等[28]研究发现，正常人群与微量蛋白尿患者尿液比较有22种不同的胞外体mi-RNA表达，尿胞外体miR-145及miR-130a在伴有微量蛋白尿的DN患者中表达更明显；相反，对比不伴有蛋白尿的糖尿病患者及健康人群，尿胞外体miR-155和miR-424表达则明显降低，而且在DN发病早期，胞外体miR-145水平在尿液和肾小球中都表现为高表达。该研究通过对早期DN动物模型的研究提示，尿胞外体中miR-145水平升高与肾小球内miR-145的过表达是一致的。这一发现也预示着尿胞外体miRNA可能成为DN患者早期肾脏病变的标志物。但尿液中只有约3%的蛋白质以EVs形式存在[29]，目前的分离尿EVs方法均非常复杂、昂贵[30]。标准化收集尿液及分离EVs还需要在传统检测方法的基础上加以创新。

糖尿病患者发展至DN早期是一个缓慢过程，临床尚无早期发现及监测DN进展的特异性指标，尿足细胞标志物检测作为一项无创且易在临床开展的检测方法，有望为DN及肾脏病的诊断和治疗以及改善预后开拓新的思路与空间。尿液中完整足细胞以及足细胞碎片的定量主要是通过标记足细胞特异蛋白、mRNA及mi-RNA，其检出的阳性率及准确性有赖于各种定量方法的完善。探寻一种灵敏度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前尿足细胞标记物检测应用于DN早期临床诊断所亟待解决的问题。目前该方面的研究尚处于初始阶段，缺乏统一的标准，有待独立的、大样本研究验证。尿足细胞标记物在DN早期诊断方面的潜在价值还需要进一步探索。

参考文献：

[1] 徐磊,杨波,郑金亮,等.足细胞的结构功能与蛋白尿发生的研究进展[J].中国医药指南,2013,11(36):364-365.

[2] 刘文佳,曹灵.足细胞转分化及其与肾小球疾病的关系研究进展[J].山东医药,2014,54(44):95-97.

[3] Reidy K, Susztak K.Epithelial-mesenchymal transition and podocyte loss in diabetic kidney disease[J].Am J Kidney Dis, 2009,54(4):590-593.

[4] Kriz W, Shirato I, Nagata M, et al. The podocyte′s response to stress： the enigma of foot process effacement[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2013,304(4)：F333-347.

[5] 胡春丽,谢席胜,冯胜刚.糖尿病肾脏疾病足细胞损伤机制研究新进展[J].临床肾脏病杂志,2015,15(1):58-60.

[6] Dalla Vestra M, Masiero A, Roiter AM, et al. Is podocyte injury relevant in diabetic nephropathy? Studies in patients with type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2003,52(4):1031-1035.

[7] Nakamura T, Ushiyama C, Suzuki S, et al. Urinary excretion of podocytes in patients with diabetic nephropathy[J]. Nephrol Dial Transplant, 2000,15(9):1379-1383.

[8] 陈桂香,顾勇.尿液足细胞检测在肾脏病中应用的进展[J].中华肾脏病杂志,2010,26(1):66-69.

[9] Hara M, Yanagihara T, Kihara I, et al. Apical cell membranes are shed into urine from njured podocytes：a novel phenomenon of podocyte injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2005,16(2):408-416.

[10] Hara M, Yamagata K, Tomino Y, et al. Urinary podocalyxin is an early marker for podocyte injury in patients with diabetes: establishment of a highly sensitive ELISA to detect urinary podocalyxin[J]. Diabetologia, 2012,55(11):2913-2919.

[11] De Nicola L, Gabbai FB, Liberti ME, et al. Sodium/glucose cotransporter 2 inhibitors and prevention of diabetic nephropathy: targeting the renal tubule in diabetes[J]. Am J Kidney Dis, 2014,64(1):16-24.

[12] do Nascimento JF, Canai LH, Gerchman F, et al. Messenger RNA levels of podocytes-associated proteins in subjects with different degrees of glucose tolerance with or without nephropathy[J]. BMC Nephrol, 2013,(14):214.

[13] Jim B, Ghanta M, Qipo A, et al. Dysregulated Nephrin in Diabetic Nephropathy of Type 2 Diabetes: A Cross Sectional Study[J]. PLoS One, 2012,7(5):e36041.

[14] Skobeme A, Konieezny A, Schifer M. Glomerular epithelial cells in the urine：what has to be done to make them worthwhile[J]. Am J Physiol Renal Physid, 2009,296(2)：F230-F241.

[15] Kuusniemi AM, Kestil M, Patrakka J, et al. Tissue expression of nephrin in human and pig[J]. Pediatr Res, 2004,55(5):774-781.

[16] Vogelmann SU, Nelson WJ, Myers BD, et al. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2003,285(1):40-48.

[17] Sato Y, Wharram BL, Lee SK, et al. Urine podocyte mRNAs mark progression of renal disease[J]. J Am Soc Nephrol, 2009,20(5):1041-1052.

[18] Zheng M, Lv LL, Ni J, et al. Urinary podocyte-associated mRNA profile in various stages of diabetic nephropathy[J]. PLoS One, 2011,6(5):e20431.

[19] Lioudaki E, Stylianou KG, Petrakis I, et al. Increased urinary excretion of podocyte markers in normoalbuminuric patients with diabetes[J]. Nephron, 2015,131(1):34-42.

[20] Fukuda A, Wickman LT, Venkatareddy MP, et al. Urine podocin: nephrin mRNA ratio (PNR) as a podocyte stress biomarker[J]. Nephrol Dial Transplant, 2012,27(11):4079-4087.

[21] Li D, Lu Z, Jia J, et al. Changes in microRNAs associated with podocytic adhesion damage under mechanical stress[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2015,14(2):97-102.

[22] Liu R, Li G, Cui XF, et al. Methodological evaluation and conparison of five urinary albumin measurements[J]. J Clin Lab Anal, 2011,25(5):324-329.

[23] Szeto CC, Ching-Ha KB, Ka-Bik L, et al. Micro-RNA expression in the urinary sediment of patients with chronic kidney diseases[J]. Dis Markers, 2012,33(3):137-144.

[24] van der Pol E, Boing AN, Harrison P, et al. Classification, functions and clinical relevance of extracellular vesicles[J]. Pharmacol Rev, 2012,64(3):676-705.

[25] Zhou H, Yuen PS, Pisitkun T, et al. Collection, storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery[J]. Kidney Int, 2006,69(8):1471-147.

[26] Zubiri I, Posada-Ayala M, Sanz-Maroto A, et al. Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label-free comparative analysis[J]. J Proteomics, 2014(96):92-102.

[27] Kalani A, Mohan A, Godbole MM, et al. Wilm’s tumor-1 protein levels in urinary exosomes from diabetic patients with or without proteinuria[J]. PLoS One, 2013,8(3):e60177.

[28] Barutta F, Triearico M, Corbelli A, et al. Urinary exosomal micro-RNAs in incipient diabetic nephropathy[J]. PLoS One, 2013,8(11):e73798.

[29] Pisitkun T, Johnstone R, Knepper MA. Discovery of urinary biomarkers[J]. Mol Cell Proteomics, 2006,5(10):1760-1771.

[30] Ana Gámez-Valero, Sara Inés Lozano-Ramos, Ioana Bancu, et al. Urinary extracellular vesicles as source of biomarkers in kidney diseases[J]. Front Immunol, 2015(6):6.

(收稿日期：2015-08-15)

中图分类号：R587.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)04-0094-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.037

通信作者：沈清(E-mail: sq4817@163.com)