黄芩素联合两性霉素B对烟曲霉菌生物被膜的体外作用

李冰，陈一强，孔晋亮，罗劲，董必英

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



黄芩素联合两性霉素B对烟曲霉菌生物被膜的体外作用

李冰，陈一强，孔晋亮，罗劲，董必英

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

摘要：目的探讨黄芩素联合两性霉素B(AMB)对烟曲霉菌生物被膜的破坏作用和杀菌效果。方法采用微量液基稀释法测定黄芩素及AMB对烟曲霉菌的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MFC)；构建烟曲霉菌菌株生物被膜模型,将模型分为空白组、黄芩素组、AMB组、黄芩素+AMB组。成模24 h加入黄芩素组、AMB组、黄芩素+AMB组分别加入相应药物干预(黄芩素浓度128 μg/mL，AMB浓度8 g/mL)，空白组不干预。药物干预48 h后，结晶紫染色法行生物被膜半定量观察，胞外基质染色法荧光显微镜下观察生物被膜形态。结果生物被膜半定量结果：AMB组与空白组比较，P>0.05；黄芩素组低于AMB组和空白组，P均<0.05；黄芩素+AMB组低于黄芩素组，P<0.05。荧光显微镜下空白组和AMB组可见菌丝密集交叉缠绕，胞外基质丰富；黄芩素组菌丝仍密集交叉在一起，但菌丝细长、光滑，无明显胞外基质；黄芩素+AMB组菌丝明显减少，无明显胞外基质。结论黄芩素可以破坏烟曲霉生物被膜胞外基质。黄芩素与AMB联合应用可增加AMB对烟曲霉菌丝的渗透作用，提高其杀菌效果。

关键词：烟曲霉；生物被膜；黄芩素；两性霉素B

烟曲霉菌是一种常见的条件致病真菌，当宿主免疫力低下或者肺部的防御机制下降时，可引起侵袭性曲霉病、曲霉瘤或过敏性支气管肺曲霉病[1]。烟曲霉菌感染在血液科、重症监护室及呼吸科等科室最为常见，其治疗难度大，病死率高。研究发现，烟曲霉菌可在感染部位分泌大量胞外基质并紧密包绕菌丝形成具有三维结构的生物被膜，使得药物难以达到菌丝表面的靶位，可增加真菌的耐药性[2]，使治疗难度加大[3]。黄芩素、两性霉素B(AMB)均为治疗烟曲霉菌感染的常用药物，二者联用是否有协同作用相关报道较少。2014年12月~2015年5月，我们观察了二者联合应用对烟曲霉菌生物被膜的体外破坏作用，现分析结果，旨在为临床治疗烟曲霉菌感染提供参考。

1材料与方法

1.1材料菌株及载体：受试菌株为临床株，由广西医科大学第一附属医院检验科细菌室提供，经本课题组前期试验研究鉴定为成膜能力最强的4号烟曲霉菌株。医用聚氯乙烯薄片(上海景年医疗器械有限公司)，裁成1 cm×1 cm，作为真菌生物被膜载体，“84”消毒液浸泡过夜后75%乙醇浸泡15 min，50 ℃烘干备用。主要试剂：黄芩素(陕西慈缘生物技术有限公司)，AMB(Amresco，USA)，药物均以粉剂形式提供，用100% DMSO溶解，储存浓度分别为102.4 mg/mL和3.2 mg/mL，-80 ℃保存；RPMI 1640粉(Gibco，USA)，MOPS(Sigma，USA)，结晶紫(Sigma，USA)，马铃薯葡萄糖琼脂(中国陆桥技术责任有限公司)，FITC-ConA染液(Vector Laboratories，USA)。主要仪器：96、24孔细胞培养板(Corning，USA)，智能生化培养箱(SPX型，宁波江南仪器厂)，漩涡混合仪(广州仪科实验室技术有限公司)，全波长酶标仪(Multiskan GO，USA)，倒置荧光相差显微镜(Olympus IX71+DP73+cellSens，日本)。

1.2实验方法

1.2.1黄芩素及AMB的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)测定根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)颁布的M38-A2标准用微量液基稀释法[4]分别测定黄芩素、两性霉素B对4号烟曲霉菌株的MIC和MFC，ATCC22019近平滑念珠菌作为质控菌株。测定结果为黄芩素对4号烟曲霉菌株的MIC>128 μg/mL；AMB对4号烟曲霉菌株的MIC为1 μg/mL，MFC为8 μg/mL。

1.2.2烟曲霉菌菌株生物被膜模型制备将4号烟曲霉菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化3~5 d，含0.025% Tween20的PBS冲洗斜面收集孢子，经MOPS缓冲后调节pH为6.9～7.1的RPMI 1640培养液重悬孢子，血细胞板计数调整其终浓度为1×105/mL[5]。取无菌载体置于24孔板中，加入1 mL配置好的孢子悬液，37 ℃培养，间隔24 h更换RPMI 1640培养液，培养24 h得到早期生物被膜模型[6]。

1.2.3实验分组及干预将生物被膜模型分为空白组(不加药)、黄芩素组、AMB组、黄芩素+AMB组。黄芩素的MIC测量范围为0.25~128 μg/mL，AMB的MIC测量范围为0.062 5~32 μg/mL，本试验使用的药物浓度为黄芩素128 μg/mL，AMB 8 g/mL。于建模24 h按上述浓度加入药物，每孔1 mL，加入药物前用PBS轻轻漂洗载体1次，37 ℃孵育，每间隔24 h换药1次，药物作用48 h后取出载体。

1.2.4生物被膜半定量采用结晶紫染色法。各组药物作用48 h后分别取出载体，用灭菌PBS轻轻漂洗载体表面浮游菌3次，加入2.5%戊二醛2 mL固定2 h，加入1%结晶紫染色15 min，用灭菌的生理盐水洗脱未结合的结晶紫，将载体移至新的24孔板，室温干燥后用1 mL 95%乙醇脱色10 min，将洗脱液混匀后转移至96孔板，100 μL/孔，设3个复孔，酶标仪检测OD570[7]。每组重复3次取平均值，实验重复3次。

1.2.5生物被膜形态观察各组药物作用48 h后，分别取出载体，用灭菌PBS轻轻漂洗载体表面浮游菌3次，每孔加入100 μL以灭菌，双蒸水配制的25 μg/mL的FITC-ConA染液没过载体，避光染色90 min，灭菌生理盐水轻轻漂洗去除多余的染料，倒置相差荧光显微镜下观察生物被膜形态[8]。

2结果

2.1生物被膜半定量结果空白组、AMB组、黄芩素组、黄芩素+AMB组烟曲霉生物被膜定量OD570分别为1.997±0.262、1.830±0.263、1.093±0.145和0.679±0.147；AMB组与空白对照组比较，P>0.05；黄芩素组低于空白组及AMB组，P均<0.05；黄芩素+AMB组低于黄芩素组，P<0.05。

2.2生物被膜形态变化空白组和AMB组可见菌丝密集交叉缠绕，胞外基质丰富；黄芩素组菌丝仍密集交叉在一起，但菌丝细长、光滑，无明显胞外基质；黄芩素+AMB组菌丝明显减少，无明显胞外基质。见插页Ⅰ图1。

3讨论

黄芩素是黄芩的提取物之一，具有清热、抗炎、抗变态反应、止血安胎等功效。体外研究发现，黄芩素对绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等微生物的生物被膜均有抑制作用[9~11]。目前黄芩在临床广泛用于上呼吸道感染、泌尿系统感染等的治疗。AMB作为杀真菌剂，其作用机制是与真菌细胞膜上的重要成分麦角甾醇结合，形成“小孔”，导致细胞膜的屏障功能受损，细胞质重要成分外漏、流失，有毒物质或无用物质内渗，真菌生命力下降，直至死亡[12]。目前，黄芩素对生物被膜的具体作用机制仍待进一步研究，我们猜测黄芩素可能是通过基因和蛋白质水平导致烟曲霉胞外基质的合成减少，也可能是通过理化作用或生物酶解作用增强对烟曲霉胞外基质的破坏和清除。

本研究结果显示，AMB组被膜定量及定性指标与空白组比较差异均无统计学意义，提示生长24 h的烟曲霉已能够分泌大量胞外基质，保护生物被膜内部菌丝不被AMB杀灭。黄芩素组被膜定量均明显低于空白组和AMB组，提示亚抑菌浓度下的黄芩素可破坏烟曲霉已形成的生物被膜。黄芩素联合AMB作用后OD570进一步降低，荧光显微镜下菌丝变得清晰、稀疏、皱缩，说明黄芩素破坏烟曲霉所产生的胞外基质后，使AMB得以有效与菌丝细胞膜上的靶位结合，增加细胞膜的通透性，达到杀菌作用。以上研究表明，黄芩素可破坏烟曲霉菌生物被膜的胞外基质，促进AMB的渗透性，起到协同杀菌作用。本实验结果为进一步研究黄芩素对烟曲霉生物被膜干预作用的相关研究奠定了基础，为临床最终控制烟曲霉生物被膜相关感染提供参考。

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Effects of baicalein combined with amphotericin B on aspergillus fumigatus biofilm in vitro

LIBing,CHENYiqiang,KONGJinliang,LUOJing,DONGBiying

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the destructive effect and sterilizing effect of baicalein combined with amphotericin B (AMB) on aspergillus fumigatus biofilm. MethodsThe broth microdilution method was employed to test the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of baicalein and AMB, and the biofilm models of aspergillus fumigatus were established, and the models were divided into the blank group, baicalein group, AMB group and baicalein+AMB group. After modeling for 24 hours, the corresponding drugs were added to the baicalein group, AMB group and baicalein+AMB group. After 48-hour intervention, crystal violet assay was operated for the semi-quantification and extracellular matrix was used to observe the biofilm morphology under fluorescence microscopy. ResultsCrystal violet semi-quantification indicated that there was no significantly difference between AMB group and the control group (P>0.05), the biofilm of the baicalein group was significantly lower than that of either AMB group or the control group (P<0.05), and the baicalein+AMB group was lower than the baicalein group (P<0.05). Fluorescence microscopy showed that the hypha of control group and AMB group was crossed and encoded with rich extracellular matrix, the hypha of the baicalein group was still intensively crossed and became smoother and slender with less extracellular matrix, in the baicalein+AMB group, mycelium was significantly reduced with hardly extracellular matrix. ConclusionsBaicalein can destroy the extracellular matrix of aspergillus fumigatus biofilm. Baicalein combined with AMB can increase the penetration of AMB on aspergillus fumigatus and improve its sterilizing effect.

Key words:aspergillus fumigatus; biofilm; baicalein; amphotericin B

(收稿日期：2015-11-09)

中图分类号：R974

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)04-0005-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.04.002

通信作者简介：陈一强(1959-)，男，教授、主任医师，主要研究方向为呼吸系统感染性疾病、支气管哮喘、肺栓塞。E-mail： chenyq0708@sina.com。

作者简介：第一李冰(1990-)，女，主要研究方向为呼吸系统感染性疾病。E-mail： 419867626@qq.com。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81260002)。