纳洛酮对ARDS大鼠血浆β-内啡肽及肺组织NF-κB表达的影响

崔青松，金明根，黄莉花，夏书香，安昌善

(延边大学附属医院，吉林延吉133000)



·基础研究·

纳洛酮对ARDS大鼠血浆β-内啡肽及肺组织NF-κB表达的影响

崔青松，金明根，黄莉花，夏书香，安昌善

(延边大学附属医院，吉林延吉133000)

目的观察纳洛酮对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠血浆β-内啡肽(β-EP)及肺组织核转录因子-κB(NF-κB)表达的影响。方法将30只大鼠随机分为对照组、ARDS组、纳洛酮组，采取股静脉注入油酸建立ARDS模型，纳洛酮组注入油酸后再注入纳洛酮注射液1.0 mg/kg，ARDS组注入油酸后再注入等量生理盐水，对照组仅注入生理盐水。测定各组血浆β-EP；处死大鼠，测算左肺湿/干重比值；取右肺中叶，采用免疫组化染色法检测NF-κB表达；取右肺上叶，观察组织病理变化。分析血浆β-EP与肺组织NF-κB阳性细胞表达率及左肺湿/干重比值的相关性。结果ARDS组与对照组比较，血浆β-EP、左肺湿/干重比值、肺组织NF-κB阳性细胞表达率均升高(P均<0.01)；纳洛酮组与ARDS组比较，血浆β-EP、左肺湿/干重比值、肺组织NF-κB阳性细胞表达率均下降(P均<0.01)。肺组织病理检查显示，ARDS组Ⅰ型肺泡上皮细胞及内皮细胞肿胀、坏死，Ⅱ型肺泡上皮细胞出现板层小体变性、破坏、排空现象，肺泡腔内可见炎症细胞；纳洛酮组肺泡、肺间质病变明显减轻；对照组无上述改变。相关性分析显示，血浆β-EP、肺组织NF-κB阳性细胞表达率与左肺湿/干重比值呈正相关(r分别为0.893、0.975，P均<0.01)，血浆β-EP与肺组织NF-κB阳性细胞表达率呈正相关(r=0.958，P<0.01)。结论纳洛酮可抑制血浆β-EP升高，阻断肺组织NF-κB激活，减轻ARDS大鼠肺组织炎症反应，减轻肺间质、肺泡水肿。

纳洛酮；急性呼吸窘迫综合征；核转录因子-κB；β-内啡肽；油酸；大鼠

急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病机制复杂，病死率居高不下，是ICU患者死亡的主要病因之一[1]。纳洛酮为阿片受体专一拮抗剂，通过竞争性地与阿片受体结合产生药理作用，抑制机体全身炎症反应，稳定细胞膜对钙离子通透性，减少肺组织及细胞损伤，从而降低肺血管的通透性。2014年1月～2015年1月，我们采用油酸诱导ARDS大鼠模型，观察纳洛酮对ARDS大鼠血浆β-EP及肺组织NF-κB表达的影响，探讨纳洛酮对ARDS的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料健康SD大鼠30只，雌雄不拘，8周龄，体质量(200±20)g，由延边大学实验动物中心提供。油酸(沈阳市东兴试剂厂)，盐酸纳洛酮注射液(北京凯因科技股份有限公司)，NF-κB测试盒(武汉博士德生物工程有限公司)，β-EP酶联免疫吸附试剂盒(加拿大HCB公司)。

1.2动物分组与处理将大鼠随机分为对照组、ARDS组、纳洛酮组各10只。由大鼠左下腹注入20%乌拉坦1.0 g/kg腹腔麻醉，剥离股动脉和股静脉，并将自制静脉管插入股静脉。对照组向股静脉缓慢注入生理盐水4.1 mL/kg，ARDS组先注入油酸0.1 mL/kg再缓慢注入生理盐水4.0 mL/kg，纳洛酮组先注入油酸0.1 mL/kg再缓慢注入纳洛酮注射液1.0 mg/kg(溶于生理盐水2.0 mL/kg)。以注入油酸后大鼠出现呼吸频率增快、呼吸窘迫表现，鼻腔溢出粉红色分泌物为模型制作成功。

1.3观察指标

1.3.1血浆β-EP给药后3 h腹主动脉采血，离心分离血浆，-40 ℃冻存，使用酶联免疫吸附试剂盒检测β-EP。

1.3.2左肺湿/干重比值腹主动脉取血后立即处死大鼠，取左肺称取湿重，置68 ℃恒温箱48 h完全脱水，称干重，计算左肺湿/干重比值。

1.3.3肺组织NF-κB阳性细胞表达率采用免疫组化方法检测。取右肺中叶，甲醛固定，石蜡包埋、切片。切片常规脱蜡至水；加入H2O2灭活内源性过氧化酶，滴加复合消化液反应10 min。加入牛血清封闭液，室温10 min，PBS冲洗。一次加入一抗NF-κB p65小鼠单克隆抗体、羊抗小鼠IgG-HRP多聚体，PBS冲洗。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。于高倍镜下观察同一切片的5个不同视野，每个视野计数100个细胞，记录阳性细胞数量，计算阳性细胞表达率。

1.3.4肺组织病理取右肺上叶，甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理改变。取右肺下叶，切成约1 mm3的小块，戊二醛固定，丙酮逐级脱水，混合树脂包埋，切片，醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，电镜下观察肺组织病理改变。

1.4统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料行方差分析和t检验，相关性分析采用偏相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三组血浆β-EP比较对照组、ARDS组、纳洛酮组血浆β-EP分别为(40.55±2.68)、(65.57±1.93)、(55.29±1.82)pg/mL，ARDS组、纳洛酮组均高于对照组，ARDS组高于纳洛酮组(P均<0.01)。

2.2三组左肺湿/干重比值比较对照组、ARDS组、纳洛酮组左肺湿/干重比值分别为4.23±0.12、5.95±0.11、5.17±0.72，ARDS组和纳洛酮组均高于对照组，ARDS组高于纳洛酮组(P均<0.01)。

2.3三组肺组织NF-κB阳性细胞表达率比较对照组、ARDS组、纳洛酮组肺组织NF-κB阳性细胞表达率分别为15.19%±1.99%、56.01%±1.77%、35.32%±2.60%，ARDS组和纳洛酮组均高于对照组，ARDS组高于纳洛酮组(P均<0.01)。

2.4病理检查结果光镜观察发现，ARDS组肺泡萎缩，肺泡腔内见渗出性液，可见中性粒细胞和泡沫样细胞，部分位置见透明膜形成，肺间质明显水肿、增厚，血管周围见套袖状水肿。纳洛酮组上述病变轻，肺泡萎缩有所改善，肺泡、肺间质病变减轻，肺泡腔内渗出性液、中性粒细胞减少，偶见泡沫样细胞。电镜观察发现，ARDS组可见Ⅰ型肺泡上皮细胞及内皮细胞肿胀和坏死，Ⅱ型肺泡上皮细胞出现板层小体变性、破坏、排空现象，见大小不均的空泡，肺泡表面覆盖一层条索状物质，肺泡间隔增宽，肺泡腔内可见炎症细胞；纳洛酮组上述变化比较轻。

2.5相关性分析血浆β-EP、肺组织NF-κB阳性细胞表达率与左肺湿/干重比值呈正相关(r分别为0.893、0.975，P均<0.01)，血浆β-EP与肺组织NF-κB阳性细胞表达率呈正相关(r=0.958，P<0.01)。

3　讨论

ARDS由严重感染、创伤、休克、误吸和手术等多种原因引起，以肺泡毛细血管膜损伤导致的肺水肿、肺内微血栓形成为病理特征[2]，临床主要表现为呼吸窘迫和顽固性低氧血症。ARDS发病机制复杂，发病急骤，预后不良。文献报道，ARDS的病死率高达50%[3,4]，是ICU病死率增加的重要因素[5]。油酸是一种对内皮细胞具有毒性作用的脂肪酸，注入机体后可引起毛细血管内皮损伤，脂肪栓子阻塞肺毛细血管造成微循环障碍。本研究显示，向大鼠股静脉注入油酸后，大鼠出现呼吸增快、呼吸窘迫表现；左肺湿/干重比值显示肺重量增加；外观呈暗红色，并有灶性坏死；光镜下可见肺微血管淤血，微血栓形成及小灶性出血，肺间质和肺泡内水肿，透明膜形成，大片肺泡萎缩；电镜下可见Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞变性明显，Ⅱ型上皮细胞板层小体排空明显，具有明显的ARDS表现。

β-EP是一种内源性阿片肽，在下丘脑和垂体释放、作为神经介质。血浆中的β-EP作用于吗啡受体，抑制呼吸中枢，在肺微血管通透性中起媒介作用[6]，使肺微血管通透性增高，促进肺水肿。机体在急性应激状况下，会释放大量内阿片肽，使脑脊液、血浆和大脑区的内源性阿片肽增多，尤其是β-EP明显升高[7]。本研究显示，ARDS组、纳洛酮组血浆β-EP较对照组明显升高。提示β-EP是参与ARDS病程的重要介质之一。相关分析表明，β-EP与左肺湿/干重比值呈正相关，提示血浆β-EP可间接影响肺水肿。

NF-κB由两个属于Rel家族的亚单位组成，以同二聚体或异二聚体形式存在。当各种刺激因素激活靶细胞，使NF-κB抑制蛋白被磷酸化、泛素化，解离而释放出游离的NF-κB，转移到细胞核中，与靶基因启动子特异性序列结合，激活其高表达[8]，可以启动多种炎性反应[9,10]。本研究发现，ARDS组、纳洛酮组的肺组织NF-κB阳性表达率较对照组明显升高，提示NF-κB参与了ARDS发病过程。相关分析表明，NF-κB阳性细胞表达率与左肺湿/干重比值、血浆β-EP呈正相关，提示NF-κB启动炎症级联反应，激活中性粒细胞和血管内皮细胞等效应细胞，能间接影响肺部炎症，影响β-EP释放，进一步加重肺水肿。

纳洛酮为特异性吗啡受体拮抗剂，为内源、非特异性阿片受体阻断剂，脂溶性高并迅速分布全身，尤以脑、肺、肾和心脏中浓度较高。本研究显示，早期应用纳洛酮的大鼠，左肺W/D、血浆β-EP水平一定程度降低，肺泡上皮细胞NF-κB活性一定程度被抑制，镜下见纳洛酮组病理改变明显减轻。其机制可能为：纳洛酮可抑制机体全身炎症反应，并通过抑制巨噬细胞等炎性细胞聚集和内流到肺组织，稳定溶酶体膜，改善微循环，降低肿瘤坏死因子水平[11，12]，减少β-EP生成，遏制钙离子内流、活性氧释放以及脂质过氧化，抑制体内细胞因子及花生四烯酸代谢物生成和血小板聚集，保护肺细胞膜，减轻组织细胞损伤，降低肺血管通透性，从而减轻肺水肿。

综上所述，纳洛酮可抑制血浆β-EP升高和肺组织NF-κB激活，减轻ARDS大鼠肺组织炎症反应，减轻肺间质、肺泡水肿，对油酸所致的大鼠ARDS有一定的治疗作用。

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吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(吉教科合字2012-D14)。

金明根(E-mail: jinmg@ybu.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.22.010

R563.8

A

1002-266X(2016)22-0031-03

2016-02-19)