山羊TTF-1基因的表达及其分子生物学特性

韩芬霞,蒋雪蒙,侯苏梅

（河南科技学院,河南新乡453003）

山羊TTF-1基因的表达及其分子生物学特性

韩芬霞,蒋雪蒙,侯苏梅

（河南科技学院,河南新乡453003）

甲状腺转录因-1（TTF-1）是NKx组织特异性转录因子家族中的一员.TTF-1基因可能是调节哺乳动物初情期的关键基因.采取山羊的甲状腺、下丘脑、垂体、大脑、卵巢等与青春期发育和繁殖性能有关的组织样,采用RT-PCR方法来检测TTF-1基因在以上组织中的表达特性.结果表明：TTF-1基因在甲状腺、下丘脑、垂体、大脑、卵巢中均有表达,为进一步研究山羊TTF-1基因及其对哺乳动物繁殖性能的影响提供理论基础.

山羊；TTF-1基因；RT-PCR；表达

甲状腺转录因子-1（TTF-1）为NKx转录因子家族成员[1],是调控细胞分化及特异功能维持的关键因子,在胚胎和发育成熟的甲状腺、肺上皮细胞中表达[2-4].Lee等[5]研究发现TTF-1基因可能是影响哺乳动物青春期早期主要激活活动的因素.Ojeda博士的科学研究小组在2004年的神经学年会上公布了他们的发现[6],在性发育开始时,下丘脑中的一个分泌细胞群中存在TTF-1基因的表达；在非人类的灵长动物青春期开始时,该基因的表达水平有所上升.在随后的研究中,他们又发现当选择性的删除小鼠神经元中的TTF-1基因后,小鼠的性成熟期推迟,可生育时间缩短,产仔次和窝产子数均减少,表明TTF-1基因存在于控制性发育和生殖功能的室周核和神经元内,因此该基因与动物的繁殖机能有着密切关系.

本研究对山羊的甲状腺,下丘脑,垂体,大脑及卵巢等组织进行采样、进行RT-PCR检测TTF-1在各组织中的表达情况,为进一步研究TTF-1基因与山羊繁殖机能及多胎的相关性奠定基础.

1 材料及方法

1.1 试剂

试验样品采自莎能奶山羊（外来品种和本地品种的杂交）,由辉县山羊养殖农户提供.采集样品部位：1甲状腺,2下丘脑,3垂体,4大脑,5卵巢,-70℃保存.

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取使用TRIzol一步法提取总RNA,-70℃保存[7].

1.2.2 引物引物根据GenBank已公布TTF-1基因,进行同源性比对,参照韩芬霞在GenBank发表的绵羊TTF-1基因序列（登录号FJ177515.2）[8],利用Primer Premier V5.0和Primer 3软件进行设计.TTF-1基因所设计引物序列为：

SP1（上游）：5’-TGTCGATGAGTCCAAAGCAC-3’（20 bp）

SP2（下游）：5’-TGTTCCGCATGGTGTCCT-3’（18 bp）

1.2.3 RT-PCR反应RT-PCR反应体系：Total RNA 1.00 μL,MgCl2（25 mmol/L）2.00 μL,10×RT Buffer 1.00 μL,dNTP Mixture（10 mmol/L）1.00μL,RNase Inhibitor（40 U/μL）0.25 μL,AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μL）0.50 μL,Oligo dT-A daptor Primer（2.5 μmol/L）0.50 μL,加入RNase Free dd H2O到10.00 μL. RT反应条件：30℃10 min,42℃30 min,99℃5 min,5℃5 min.

PCR反应体系：模板DNA 1.0 μL,PCR Buffer 2.5 μL,dNTP1.0 μL,上、下游引物各1.0 μL,TagDNA聚合酶0.5 μL,加超纯水至25 μL.PCR反应条件：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,55℃退火20 s,72℃延伸20 s,35个循环,最后72℃终延伸5 min.

1.2.4 目的片段克隆与测序回收TTF-1基因的RT-PCR产物,将回收产物与pGEM-T载体连接,转化入大肠杆菌DH 5α,经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定,选择3个阳性克隆送上海生工进行测序.

1.2.5 生物信息学分析通过生物软件DNAStar中的SeqMAN程序构建TTF-1基因的DNA序列.

2 结果与分析

2.1 RT-PCR扩增结果

RT-PCR扩增结果见图1.

图1 山羊TTF-1基因表达部位检测Fig.1 Detecting of the expression position of TTF-1 in goat

由图1可以看出,RT-PCR扩增后所得的条带大小跟预期的条带基本一致,在甲状腺、肺、肝脏、肾脏、卵巢中均检测到320 bp左右的片段,可初步判断TTF-1基因在这几个部位有表达.

2.2 测序结果

对RT-PCR的产物进行回收、克隆,送由上海生工测序.测序结果表明：试验得到的DNA片段为318bp,经BLAST同源性分析,与绵阳TTF-1基因序列相比,同源性为100%,可确定为山羊TTF-1基因的序列.测序结果如下：

3 讨论

卵巢是卵泡的发育场所,卵巢分泌的雌激素可正负反馈与下丘脑和垂体,促进或抑卵泡的生长和发育.本研究对TTF-1基因在甲状腺、下丘脑、垂体、大脑和卵巢等组织样进行RNA的提取、RT-PCR、测序,测序结果与已知的绵羊TTF-1基因片段基本一致.这就表明,TTF-1基因在与山羊青春期发育和繁殖机能有关的组织中都有表达.

溴化乙锭是琼脂糖凝胶电泳中的荧光染色剂,当染料插入分子后,与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离染料有所增加.从图1可看出,前三个条带的亮度和宽度明显优于后两个,说明TTF-1基因虽然在各个样本中都有表达,但相对来说,在甲状腺、下丘脑、垂体中的表达量可能大于其在大脑、卵巢中的表达,但对这一基因在各自组织样中具体表达量的多少,还需要进一步研究证明和补充.

4 小结

本试验发现TTF-1基因不仅在甲状腺、下丘脑、垂体、大脑等与内分泌调节有关的组织中表达,还特异性的在影响山羊繁殖性状的卵巢中表达,这为进一步研究山羊TTF-1基因及其功能,寻找影响山羊发情的主基因和多胎性提供了理论依据.

[1]Agoff S N,Lamps L W,Philip A P,et al.Thyroid Transcription Factor-1 is expressed in extrapulmonary neuro endocrine tumors[J]. ModPathol,2000,13：238-242.

[2]Civitareal D,Lonigro R,Sinclair A J,et al.AThyroid-Specific Nuclear-Protein essential for Tissue-Specific expression of the thyroglobilin promoter[J].Embo Journal,1989,8（3）：35-42.

[3]Wert S E,Dey C R,Blair P A,et al.Increased expression of thyroid transcription Factor-1（TTF-1）in respiratory epithelial cells inhibits alveolarization and causes pulmonary inflammation[J].Dev.Biol.,2002,242：75-87.

[4]Breedveld G J,Jeroen W F,Danesino C,et al.Mutations in TTF-1 are associated with benign hereditary chorea[J].Human Molecular Genetics,2002,11（8）：971-979.

[5]Lee B J,Cho G J,Norgren R,et al.TTF-1,a homeodomain gene required for diencephalic morphogenesis,is postnatally expressed in the neuroendocrine brain in a developmentally regulated and cell-specifc fashion[J].Molecular and Cellar Neuroscience,2001,17（1）：107-126.

[6]OHSUscientistsidentify key gene that delays female puberty[EB]//Ol.（2004-10-25）[2010-12-08].http：//www. sciencedaily.com/releases/2004（10）/041025124145.htm.

[7]萨姆布鲁克J,弗里奇E F,曼尼阿帝斯T.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社,2002.

[8]韩芬霞.绵羊TTF-1基因的克隆、序列分析及表达部位检测[D].兰州：甘肃农业大学,2009.

（责任编辑：卢奇）

Study on the expression and characterization of TTF-1 gene in goat

HAN Fenxia；JIANG Xuemeng；HOU Sumei
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Thyroid transcription factor-1 belongs to NKx tissues's specific transcription factor.Some studies indicate that TTF-1 gene could be a critical gene which regulate puberty of mammalian.The thyroid,hypothalamus,hypophysis, brain,ovary which have a close relation with mammalian's adolescent development and reproductive trait were taked to detect the expression of TTF-1 mRNA in tissues through RT-PCR.The result indicated that the TTF-1 gene is expressed respectively in thyroid,hypothalamus,hypophysis,brain,ovary,giving theory basis for further study on the TTF-1 gene of goat and the effect on reproductive trait of mammalian.

goat;TTF-1 gene;RT-PCR;expression

S827

A

1008-7516（2016）01-0043-03

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.01.010

2015-12-02

国家大学生创新项目(201310467060);河南省教育厅自然科学项目(15A230001)

韩芬霞(1978-),女,甘肃会宁人,硕士,讲师.主要从事动物遗传育种工作.