基于乳酸菌试管计数法的改进研究

2016-04-06齐美园赵鹏昊朱云鹏东北农业大学食品学院黑龙江哈尔滨150030

中国新技术新产品 2016年3期

方正齐美园赵鹏昊张青朱云鹏（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

基于乳酸菌试管计数法的改进研究

方正齐美园赵鹏昊张青朱云鹏
（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

摘要：研究表明试管计数法利用高层琼脂的良好厌氧性能够很好地培养和计数乳酸菌，而实验发现试管法在菌落计数的过程中，仍有部分缺点和不足。本研究对原试管法的装置做了新的改进，将改进后的试管法与原试管法对比，证实了改进后的试管法能够更快速、准确地对乳酸菌进行计数。

关键词：乳酸菌；计数；试管法；改进

目前，乳酸菌已被广泛应用于食品工业中，研究表明大部分乳酸菌为微好氧菌、兼性厌氧菌或专性厌氧菌，马向前等率先提出利用试管法对乳酸菌等不产气厌氧或兼性厌氧菌的简便快速活菌计数，赵强忠等又在前者的实验基础上进行了方法上改进，但由于很多菌落生长在试管中间且分布无序以及试管构造的特点，观察时易产生重影，导致不易计数。

本研究为了使试管法能够更快速、准确计数，对原试管法的装置进行了改进。装置描述：将大试管（外管）加上硬质橡胶塞，橡胶塞上连有灰黑色的同材质实心柱体（内芯），内芯与外管间形成薄层区域。使用方法：在无菌的环境中，将已经灭菌的橡胶塞拔下，取融化的约10mL琼脂培养基注入大试管中，接种后，盖上橡胶塞，此时培养基被内芯挤压到外管的周围，形成一个薄的培养基层，用于乳酸菌的培养和计数。本试验通过将改进后的试管法作为试验方法，赵强忠等所用的原试管法作为对照，研究改进后的试管法的实际使用效果。

1　材料和方法

1.1试验材料

1.1.1菌种

鼠李糖乳杆菌GG株（下简称LGG）、保加利亚乳杆菌（下简称LB）。（由东北农业大学乳品教育部重点实验室提供）

1.1.2培养基：MRS培养基，按GB 4789.35-2010配制。

1.1.3试剂：草酸铵结晶紫，碘液，番红，酒精等。

1.1.4仪器和设备：高压蒸汽灭菌锅；恒温培养箱；电热恒温水浴锅；振荡器；移液器；显微镜；锥形瓶；酒精灯等。

1.2试验方法

1.2.1乳酸菌的活化和镜检

将LGG和LB按3%接种量分别接种于MRS液体培养基中，再分别于37℃和42℃恒温箱培养16h和24h，重复活化培养3代。革兰氏染色后镜检无杂菌，备用。

1.2.2稀释液的配制

准确称量0.90g无水NaCl，加入100g水，搅拌溶解均匀，取9mL分装试管。121℃灭菌15min。

1.2.3乳酸菌的计数

（1）菌液稀释

将活化后的菌液在振荡器上震荡均匀，用移液器移取1mL，加入含有9mL试管的稀释液中，制成1∶10的稀释液，并在振荡器上震荡均匀，依此类推进行10倍稀释，将菌夜稀释到10-7。

（2）接种

改进后的试管法（方法一）：按照前述使用方法，将稀释到10-6、10-7的菌液分别取0.1mL接种，注意管中不能有气泡产生，做三个平行样。将LGG和LB分别在37℃和42℃恒温箱中培养48h。

原试管法（方法二）：将稀释到10-6、10-7的菌液分别取0.1mL接种到灭菌的试管培养基中，震荡均匀，不能有气泡产生，做三个平行样。将LGG和LB分别在37℃和42℃恒温箱中培养48h。

（3）菌落的计数

将两种方法所得到的试管菌落分别进行计数，记录菌落数量与计数时间。

2　结果和分析

2.1两种方法的结果比较

2.1.1方法一和方法二的菌落数

表1为方法一和方法二的菌落数。

2.1.2方法一和方法二的计数时间

表2为方法一和方法二的菌落计数时间。

2.2数据处理与分析

参考GB4789.35-2010中乳酸菌的检验与计数方法，若取有两个连续稀释度的菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算：

N=∑C/（n1+0.1n2）d

式中：

N——样品中菌落数；∑C——试管菌落数之和；n1——低稀释倍数的试管个数；n2——高稀释倍数的试管个数；d——稀释因子（低稀释倍数）。

由表1可知，方法一的同一批次中，三个平行样无显著性差异，检出数据较为稳定，且两个稀释度的的比值都接近理论值10，而方法二中有三组偏离10较显著。根据公式计算，方法一对LGG 和LB的计数结果分别是2.16×109cfu/mL 和1.40×109cfu/mL，方法二对LGG和LB的计数结果分别是2.09×109cfu/mL和1.27×109cfu/mL，可知方法二所得菌落数小于方法一，说明了改进后的试管法对菌数计数的检出率和准确性都优于原试管法。

由表2可知，在菌落数较少（试验中小于30）时，方法一和方法二的计数时间相差不大，但当菌落个数较多（试验中大于100）时，对于菌落数量相差不大进行数时方法二计数时间长，计数较为困难，此时改进后的试管法具有明显的优越性，体现在计数时间短，重复率更好。