高迁移率族核小体结合蛋白家族的研究进展

李晶，杨帆，魏枫，任秀宝（1天津医科大学肿瘤医院，天津300060；2国家肿瘤临床医学研究中心；3天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室）

高迁移率族核小体结合蛋白家族的研究进展

李晶1，2，3，杨帆1，2，3，魏枫2，3，任秀宝1，2，3
（1天津医科大学肿瘤医院，天津300060；2国家肿瘤临床医学研究中心；3天津市肿瘤免疫与生物治疗重点实验室）

高迁移率族核小体结合蛋白（HMGN）是一类几乎存在于所有哺乳动物和多数脊椎动物的细胞核中的非组蛋白，在活细胞内能通过与核小体结合来调节基因表达，以其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移率而得名。诸多研究证实，HMGN是与包括肿瘤在内的多种疾病发生密切相关的调控因子。HMGN家族包含五种染色体结构蛋白，即HMGN1～HMGN5，各成员作为细胞内的染色质结合蛋白，参与DNA复制与表达、细胞分化、器官发育及基因表达调控等多种细胞的生命活动。HMGN1、HMGN2通过调节某些基因或蛋白表达来影响器官发育成熟，同时还参与肿瘤免疫反应。HMGN3与人2型糖尿病的发生及肝癌化疗耐药有关。目前对HMGN4的研究相对较少。HMGN5过表达是肿瘤浸润和转移的一个重要因素。近年来关于HMGN1、HMGN2、HMGN5在肿瘤治疗方面的研究不断增多，但均停滞于临床前期阶段。

高迁移率族核小体结合蛋白；肿瘤；DNA复制

疾病的发生是遗传、病理、环境等多因素长期作用的结果，其中包含基因表达改变、细胞分化异常、凋亡及代谢紊乱等一系列病理变化过程。HMGN家族包含五种染色体结构蛋白，即HMGN1～HMGN5，他们表达于脊椎动物细胞内，具有组织特异性。HMGN家族各成员均包含一个双向核定位信号（NLS）、一个高度保守的核结合区域（NBD）及一个带负电荷的调节区域（RD）。HMGN与核小体的结合不具有序列特异性，而是由其自身NBD调控。HMGN与染色体不同结合位点的核小体瞬时结合，改变染色体的结构，进而调节其活性，影响基因表达、器官分化等生物学过程。现就HMGN家族的研究进展综述如下。

1 HMGN1

1.1 概述 HMGN1（原名HMG14）最初由Graham等于1977年从猪胸腺中提取出来。接着Johns等又从鸡红细胞核中分离出HMGN1。人的HMGN1蛋白由100个氨基酸组成，大小约10.6 kD，其编码基因位于人染色体21p22和鼠16号染色体。HMGN1除了能与DNA结合并影响其复制和转录外，亦在DNA损伤修复、器官分化发育、疾病的发生等过程中发挥作用。

1.2 HMGN1调节基因表达 HMGN1能与核小体结合从而调节基因表达。Rubinstein等［1］比较了HMGN1敲除小鼠与野生型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）DNA微阵列，结果HMGN1敲除小鼠MEFs 中N-钙黏蛋白的水平较野生型小鼠增加了4倍。这说明HMGN1能负向调节N-钙黏蛋白的表达，在小鼠发育过程中，HMGN1可能通过与染色质相互作用使MEFs中N-钙黏蛋白表达降低。对HMGN1敲除小鼠的基因表达分析显示上皮特征性标记--谷胱甘肽-S-转移酶（GST）4和GST 1明显减少，而黏附分子——E-钙黏蛋白、α-，β-，γ-连环蛋白则显著增加。免疫荧光标记发现野生型小鼠角膜基底层有HMGN1和p63共定位区域，而HMGN1敲除小鼠角膜细胞则不表达p63蛋白。据此推测，HMGN1可能与染色体相互作用，调节包括p63在内的部分基因表达，进而影响角膜的形成及成熟。

1.3 HMGN1参与器官发育 将小鼠HMGN1基因敲除后会出现角膜上皮变薄、角膜细胞减少、基底细胞减少、表皮细胞滤泡化等角膜上皮成熟障碍的现象。胚胎枝芽形成微团培养实验证实HMGN1表达减少能促进软骨细胞分化。实验证实，HMGN1是通过与Sox9基因相互作用来抑制软骨发育的。因此，HMGN1在器官分化发育中的作用不可小觑。

1.4 HMGN1参与DNA损伤修复 染色质在损伤后出现一系列的动力学变化并修复DNA。紫外线暴露（UV）研究［2］和电离辐射（IR）敏感性实验［3］证明HMGN1能通过与染色质结合并调节其功能进而增强照射后细胞的存活能力。UV和IR照射致DNA损伤后，细胞或组织的反应与毛细血管扩张性共济失调症突变基因（ATM）激酶的激活状态有关。进一步研究发现HMGN1影响ATM激酶与染色质间的相互作用，而这作用在ATM激酶激活中非常重要。最近研究还发现，HMGN1能与增殖细胞核抗原（PCNA）结合并促进PCNA与染色质的结合［4］。在细胞周期的各个阶段，PCNA均能迅速聚集到DNA损伤区域并与染色质紧密结合，促进DNA修复。因此，HMGN1通过作用于PCNA从而增强DNA的修复能力，在一定程度上减少了由DNA损伤引起的疾病发生。

1.5 HMGN1参与唐氏综合症（DS）发生 DS是首个发现由染色体缺陷造成的人类疾病，主要表现为学习障碍、智力障碍等神经发育异常症状。1959年法国遗传学家杰罗姆.勒琼发现该病是由人体的第21对染色体的三体变异造成。研究［5］发现，HMGN1可能通过调节甲基CpG结合蛋白2 （MeCP2）表达，进而导致神经发育的异常。与正常样本相比，DS样本中HMGN1上调了2倍［6］。这说明HMGN1可能参与了DS的发生。据报道，DS患儿患急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）的风险平均比普通人高20倍［7］，且最新研究［8］亦证实HMGN1过表达和染色体甲基化改变是DS相关B-ALL的主要机制。因此，HMGN1可能在DS及其相关B-ALL的发生发展中起作用。

1.6 HMGN1促进肿瘤特异性免疫反应 警报素是一类具有募集和活化树突状细胞（DC）双重作用的内源性分子，能增强抗原特异性的免疫反应。最近发现HMGN1作为一种警报素在肿瘤治疗中发挥重要作用。Yang等［9］用脂多糖免疫刺激小鼠，结果HMGN1敲除小鼠产生的抗原特异性抗体和T细胞反应明显弱于野生型对照组，这主要源于免疫区DC细胞聚集减少和炎症细胞因子产生不足。此外，HMGN1可与DC细胞膜上的Toll样受体4（TLR4）结合，进而激活DC细胞内NF-κB信号通路和多个丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路［9］。结果使免疫区聚集的DC细胞表面共刺激分子和MHC分子的表达上调，促炎细胞因子（如TNF-α、IL-12p70和IL-1）分泌增多。HMGN1可促使INF-γ分泌增多，而对IL-4无影响，说明HMGN1能促进Th1型免疫反应［9］。

魏枫等［10］将带有肿瘤相关抗原（TAA）卵清蛋白（OVA）的EG7胸腺癌细胞注入小鼠皮下，结果HMGN1敲除小鼠的皮下肿瘤细胞生长速度明显较同窝HMGN1未敲除小鼠快。四聚体染色及流式细胞术分析接种EG7细胞后小鼠的脾淋巴细胞，提示野生型小鼠产生的OVA特异性CD8+细胞比HMGN1敲除小鼠多。说明HMGN1能促进肿瘤特异性免疫反应。将不表达OVA的EL4细胞种植于C57BL/6小鼠发现，分泌型表达HMGN1的EL4细胞形成肿瘤较野生型EL4细胞慢。说明在无TAA刺激的情况下HMGN1亦能发挥抗肿瘤作用，即促进固有免疫应答抵抗肿瘤。该研究组将编码HMGN1、gp100或HMGN1-gp100融合蛋白的基因分别与胰岛素信号肽重组构建重组质粒，即pcDNA3. 1-gp100、pcDNA3.1-HMGN1和pcDNA3.1-HMGN1-gp100［10］。用这些质粒接种于C57BL/6小鼠后，结果显示，注射pcDNA3.1-HMGN1-gp100疫苗的小鼠腹股沟淋巴结和脾脏内产生的IFN-γ+CD8T细胞比对照组（接种pcDNA3.1、pcDNA3.1-gp100，pcDNA3.1-HMGN1质粒的小鼠）多。在接种小鼠的皮下种植B16F1黑色素瘤，结果与对照组（接种质粒pcDNA-gp100、pcDNA-HMGN1或两者混合的小鼠）相比，接种pcDNA3.1-HMGN1-gp100小鼠皮下未形成明显的肿瘤，且其产生的保护性抗肿瘤作用更强［10］。据此，HMGN1可能具有抑制肿瘤的作用，并有望成为抗肿瘤疫苗治疗肿瘤的佐剂。

2 HMGN2

2.1 概述 HMGN2是HMGN家族的又一亚型，是最保守的一员，其相对分子质量约为9.2 kD，共由90个氨基酸残基组成。HMGN2编码基因位于人染色体1p36和鼠4号染色体［11］，最早从鸡红细胞核中提取出。实验证明，HMGN2具有改变染色体活性、参与器官分化发育、调节DNA损伤修复等多方面功能。

2.2 HMGN2参与器官发育 最近研究表明，HMGN2不仅能在胚胎动物模型中抑制红系分化和骨细胞形成，同时能阻碍红白血病细胞向红系分化［12］。体外软骨形成微团培养实验还发现，HMGN1表达减少反而会增加HMGN2与Sox9结合。据此可推测，HMGN2可能在胚胎形成过程中参与了细胞分化。

2.3 HMGN2参与DNA损伤修复 HMGN2能与核小体结合改变染色体结构参与DNA损伤修复过程。Subramanian等用不同强度紫外线分别照射野生型和突变型DT40细胞系，结果发现敲除HMGN2使DT40细胞对紫外线敏感性增加。此外，研究者还用环丁烷嘧啶二聚体（CPD）--细胞内DNA受紫外线照射后的产物，作为DNA修复的评价指标，分别在紫外线照射后检测细胞内CPD的修复情况。结果显示，在不同时间点野生型DT40细胞CPD均较HMGN2失效突变细胞CPD修复比例高。该实验证明HMGN2能促进UV照射后损伤DNA的修复。HMGN2通过其C端与核小体组蛋白H1作用来实现与DNA结合［13］。然而，Wu等［14］证明，在E3连接酶调节下，HMGN2与泛素相关调节剂1（SUMO1）的共价结合可使HMGN2与染色质核中心体的结合能力下降。HMGN2基因染色体定位靠近某些抑癌基因，故其还可能会参与肿瘤相关基因表达的调控。

2.4 HMGN2发挥抗菌活性 实验证明，HMGN2重组蛋白具有抑制大肠杆菌、白色念珠菌、绿脓杆菌等作用。其发挥抗菌作用的主要结构可能是位于其蛋白分子18到48的一段螺旋序列。Wu等［15］用不同浓度HMGN2处理后的肺炎克雷伯杆菌03183菌株感染膀胱上皮细胞T24，结果发现与对照组相比用128 g/mL的HMGN2处理后菌株进入T24细胞的能力较弱。原因可能是HMGN2减弱了菌株黏附膀胱上皮的能力及T24细胞胞外信号调节酶的磷酸化。

2.5 HMGN2参与肿瘤免疫 Su等［16］用IL-2和植物血凝素（PHA）刺激外周血单核细胞（PBMCs），结果从这些细胞上清中分离出HMGN2。HMGN2主要由激活的CD8+T细胞分泌。提取并培养PBMCs，从中分离CD8+T细胞，用PHA或肿瘤抗原分别刺激体外分离的PBMCs和CD8+T细胞，接着分析HMGN2的表达及释放水平，发现刺激后CD8+T细胞高表达HMGN2蛋白，同时细胞上清具有抗肿瘤的作用，且这种抗肿瘤活性能被抗HMGN2抗体抑制，这说明HMGN2是激活后细胞上清中发挥抗瘤活性的主要成分之一。体外实验发现，接受HMGN2蛋白处理后的口腔鳞癌细胞［17］及HMGN2过表达的骨肉瘤细胞［18］均表现出生长抑制和细胞周期停滞。这一结果在活体肿瘤模型中亦得到验证［17，18］。

3 HMGN3

HMGN3的结构高度保守，包含两个剪接变异体，即HMGN3a和HMGN3b。HMGN3a具有经典的HMGN区域（HLS、NBD和RD），而HMGN3b缺少RD区域［11］。酵母双杂交实验发现Hela细胞中HMGN3可能通过与荷尔蒙受体结合来促进受体与染色体的相互作用。在胚胎发育的不同时期，HMGN3在眼不同部位中的含量不同，提示其可能参与小鼠眼球的发育成熟。

Barkess等［19］发现，HMGN3a/b与染色体结合使H3K14乙酰化，进一步刺激Glyt1基因表达。HMGN3协同转录因子PDX-1与葡萄糖转运基因Glut2启动子结合，从而促进Glut2表达。HMGN3敲除后小鼠接受糖刺激后的胰岛素分泌量较对照组少，而胰岛素分泌量不足又是2型糖尿病的重要发病机制，因此，HMGN3可能与2型糖尿病的发生密切相关。HMGN3广泛分布于胰腺所有内分泌胰岛细胞核内，不仅能调节胰岛素的分泌，且在胰高血糖素的分泌调节中发挥作用。实验还证实，HMGN3与人肝癌细胞的药物（如长春花碱、拓扑替康、紫杉醇、阿霉素等）抵抗有关。HMGN3有望成为抗肝癌治疗的一个靶点。

4 HMGN4

HMGN4是HMGN家族中研究最少的一种。Birger等［20］首次在基因库数据搜索中发现一种HMGN2样转录物，后被确认为HMGN4，其编码基因是一种无内含子的基因，定位于人染色体6p21 HMGN4仅存在于灵长类动物，由90个氨基酸组成，大小约9.5 kD［21］。HMGN4在人体各组织中广泛表达且具有差异性，甲状腺、胸腺和淋巴结中HMGN4 mRNA水平较高，而肝脏、胰腺、睾丸及胎脑和胎肝中HMGN4 mRNA水平较低。目前尚未见HMGN4与疾病发生相关的报道。

5 HMGN5

Michael等于2000年通过Genbank数据库检索发现HMGN5。接着2001年King和Francomano发现HMGN5蛋白编码基因的结构。HMGN5基因位于人Xp13染色体上，蛋白由282个氨基酸组成，大小约31.5 kD［11］。HMGN5包含经典的HMGN区域（NLS、NBD和RD），但其C端通常较长且有一独特酸性氨基酸重复序列。在胚胎发育过程中，不同细胞或组织中HMGN5蛋白表达水平有很大不同。

HMGN5不仅能与核小体结合调节染色体的结构和功能，进而影响DNA的复制和修复，且在肿瘤发生发展中同样发挥作用。有研究发现HMGN5蛋白在骨肉瘤［22］、乳腺癌［23］、膀胱癌［24］等多种肿瘤细胞中高表达。用小干扰RNA处理神经胶质瘤细胞使HMGN5水平降低，可使该细胞停滞于G1期且细胞凋亡比例增高，从而抑制胶质瘤细胞生长。利用包含HMGN5小发夹RNA的慢病毒质粒转染前列腺癌细胞，96 h后前列腺癌细胞增殖能力减弱22. 6%，G2/M期和S期细胞分别增加8.78%和15. 26%，凋亡细胞比例增加2.19倍。小干扰RNA质粒处理膀胱癌EJ细胞系，处理组细胞活力较对照组下降了10.6%，流式分析结果表明细胞停留于G2期［24］。体外实验［25］发现敲除HMGN5可使膀胱尿路上皮肿瘤5637细胞的体外增殖和侵袭能力减弱。敲除HMGN5能抑制5637细胞的成瘤能力。HMGN5高表达与肿瘤低分化、淋巴结浸润及远处转移密切相关［23］。研究［26］发现，HMGN5可能通过上调自噬作用引起骨肉瘤细胞的药物（如紫杉醇，甲氨蝶呤，顺铂等）抵抗。因此，HMGN5亦有望成为肿瘤治疗中的一个新靶点。

总之，HMGN家族各成员作为细胞内的染色质结合蛋白，参与DNA复制与表达、细胞分化、器官发育及基因表达调控等多种细胞的生命活动。HMGN1、HMGN2通过调节某些基因或蛋白的表达来影响器官发育成熟，同时还参与肿瘤免疫反应。HMGN3与人2型糖尿病的发生及肝癌化疗耐药有关，因此可能用于预防2型糖尿病和增强肝癌化疗疗效。目前对HMGN4的研究相对较少，期望会有其与疾病相关性的研究，从而寻找更多的临床疾病治疗策略。HMGN5过表达是肿瘤浸润和转移的一个重要因素，因此应用特异性抑制剂和靶向药物来阻碍HMGN5的促肿瘤作用，进而发挥抗肿瘤效力是有可能的。相信在不久的将来，HMGN家族能成为临床肿瘤治疗的新靶点，使更多恶性肿瘤患者从中获益。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.037

R977.6

A

1002-266X（2016）25-0103-04

天津市应用基础与前沿技术研究计划资助项目（13JCYBJC41400；14JCTPJC00476）。

任秀宝（E-mail：rwziyi@yahoo.com）

2015-11-28）