人类肝癌细胞HepG2、Bel-7402和Li-7植入裸鼠体内后微量蛋白表达分析

曾小峻，陶华林，汪碧琼，于卉（西南医科大学附属医院，四川泸州646000）

人类肝癌细胞HepG2、Bel-7402和Li-7植入裸鼠体内后微量蛋白表达分析

曾小峻，陶华林，汪碧琼，于卉
（西南医科大学附属医院，四川泸州646000）

目的 探讨HepG2、Bel-7402和Li-7不同肝癌细胞系在裸鼠体内生长过程中血清蛋白谱的表达情况，寻求与肝癌早期诊断相关的微量蛋白标志物。方法 将40只BALB/cA-nu裸鼠随机均分为4组，分别为HepG2、Li-7和Bel-7402组以及对照组，对HepG2、Bel-7402和Li-7三种癌细胞分别进行培养和传代，制备浓度为1.5×107/ mL癌细胞悬液，在每组裸鼠皮下分别注射相应的癌细胞悬液0.2 mL，对照组注射RPMI1640细胞培养基，观察裸鼠的生长情况，于注射后20、40和60 d通过摘眼球法采集裸鼠血液样本，用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪（SELDI-TOF-MS）检测微量蛋白谱，采用Ciphergen ProteinChip 3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1软件和统计学分析软件SPSS16.0对所得的数据进行分析，筛选出差异性蛋白。结果 HepG2组将HepG2细胞注射裸鼠后，在裸鼠血清中出现29个差异蛋白，规律变化明显的有8个，其中上调的有5个，下调的有3个。Li-7组将Li-7细胞注射裸鼠后，出现12个差异表达蛋白，其中表达增强的有7个，表达减弱的有5个。Bel-7402组将Bel-7402细胞注射裸鼠后，血清中出现5个差异蛋白，其中表达增强的有4个，表达减弱的有1个。结论 不同类型的肝癌细胞在裸鼠体内生长过程中会产生不同的微量差异蛋白，这些蛋白经鉴定、检测开发有望成为临床不同细胞类型肝癌早期诊断的蛋白标志物。

肝肿瘤；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪；蛋白质组学；差异性蛋白；质荷比；裸鼠

肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年上升，其病因与诱因多种多样，尤其肝细胞性肝癌（HCC），病死率高［1］。肝癌实验室检查指标主要有甲胎蛋白（AFP）及其异质体、血清酶、异常凝血酶原、铁蛋白等，但上述指标均有一定局限性，尤其敏感性和特异性在不同细胞类型的肝癌早期诊断中效果不佳，如何寻找肝癌早期诊断指标是目前倍受关注的问题之一［2，3］。2013年3月～2015年5月，我们通过在裸鼠皮下注射人类不同类型的肝癌细胞HepG2、Bel-7402和Li-7，分析在裸鼠体内与肝癌相关的蛋白表达情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 BALB/cA-nu裸鼠40只，4周龄，均为雌性，购于重庆腾鑫科技公司。HepG2、Li-7和Bel-7402细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。主要试剂和仪器：RPMI1640细胞培养基（GIBCO BRL公司，美国），胎牛血清（美国Hyclone公司），二甲基亚砜、甲醇、三氟乙酸、芥子酸、乙腈、HPLC级超纯水等（美国Sigma公司），台式高速离心机（安亭科学仪器厂，中国），二氧化碳恒温孵育箱（Thermo，美国），超低温冰箱（Thermo，美国），H50蛋白芯片（Ciphergen，美国），PBSⅡ/C型蛋白指纹图谱分析仪（Ciphergen公司，美国）。

1.2 细胞培养与传代 肝癌细胞株经复苏后加入配制好的RPMI1640细胞培养液（90%RPMI1640细胞培养基+10%胎牛血清）约5 mL，拧松瓶盖置于恒温孵箱（37℃，5%CO2）中培养。当细胞贴壁面积大于80%时，立即传代，弃原有培养液，PBS工作液洗涤2次，加入约1 mL的胰酶细胞消化液，将瓶底完全覆盖，待细胞形态开始变圆，细胞间隙增大时，立即弃去胰酶细胞消化液，加入培养液以终止消化，用吸管将细胞轻轻吹打下来，使其分散开，成为单个细胞悬液。根据具体情况，将细胞悬液传至2 ～3个新培养瓶内，同时加入新的培养液，使总液体维持在5 mL左右，随后，拧松瓶盖轻放入孵箱并轻晃培养瓶使细胞均匀分散于瓶底。

1.3 癌细胞悬液制备 选择处于对数生长期的HepG2、Bel-7402和Li-7细胞，按照细胞传代的步骤进行消化，离心（4 000 r/min，3 min）后弃上清液，加入RPMI1640细胞培养基（无胎牛血清）重悬细胞，随后混匀计数，配制浓度约为1.5×107/mL的癌细胞悬液。

1.4 细胞分组及处理 将40只BALB/cA-nu雌性裸鼠随机均分为4组，分别为HepG2组、Bel-7402组、Li-7组和对照组，每组裸鼠分别用相应的癌细胞悬液（1.5×107/mL）作皮下接种，剂量为0.2 mL，对照组接种RPMI1640细胞培养基。

1.5 裸鼠血清标本微量蛋白谱测定 各种癌细胞注射裸鼠后，分别于第20、40和60天时，采用摘取眼球法采集血标本，待血液凝固后离心（6 min，6 000 r/min），将获得的血清分装在新的Eppendof管中，做好标记，冻存于超低温冰箱中备用。委托北京伯奥克蛋白指纹图谱技术有限公司检测微量蛋白谱。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。采用Ciphergen ProteinChip3.0和Ciphergen Biomaker Wizard 3.1软件和对所获得的数据进行分析，筛选出差异性蛋白，对两组样本进行差异表达增强或减弱的质荷比（M/Z）计算。

2 结果

2.1 HepG2细胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表达HepG2组将HepG2癌细胞注射裸鼠后，血清中出现29个差异蛋白，规律变化较强的有8个，其中上调的有5个，M/Z分别为3 701.15、4 560.87、8 169.14、8 258.08和1 2047.4；下调的有3个，M/Z分别为1 025.35、1 045.15和4 319.54。

2.2 Li-7细胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表达Li-7细胞注射裸鼠后，在Li-7组和对照组中同时出现12个差异表达蛋白，其中表达增强的有7个，M/ Z分别为1 087.44、1 179.59、1 192.62、1 483.17、1 563.21、6 646.16和3 763.01，表达减弱的有5个，M/Z分别为1 027.39、3 869.26、4 319.54、8 793.72和9 259.75。

2.3 Bel-7402细胞注射裸鼠皮下后血清中蛋白表达 Bel-7402细胞注射裸鼠后，在Bel-7402组和对照组裸鼠血清中同时出现的差异蛋白有5个，其中表达增强的有4个蛋白，M/Z分别为2 016、3 309、3 442、3 745，表达减弱的有1个蛋白，M/Z为2 747。

3 讨论

在病理分类中，每一种肿瘤均有不同的亚型，其临床表现和治疗方法均存在差异，同一种肿瘤，细胞系也存在多个，不同细胞系的肿瘤，其发生、发展过程中，在体内的蛋白表达是否有差异，为了给临床肿瘤早期诊断和治疗提供更多的依据，全面了解肿瘤的特征，本研究根据中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心所提供的肝癌细胞系的情况，针对HepG2、Li-7和Bel-7402三种肝癌细胞在动物体内的生长和蛋白表达情况进行研究。

HepG2、Li-7和Bel-7402三种肝癌细胞在裸鼠中的致瘤性不同，只有Bel-7402肝癌细胞具有致瘤性，其他两种细胞均不致瘤，可能原因：①每个作者研究所用裸鼠的品种及性别不完全相同；②有的研究使用的是自己实验室保存的细胞系，可能是细胞在长期传代过程中，出现了变异，造成其在裸鼠中致瘤的现象，亦可能是长期使用的细胞受到了其他肿瘤细胞的污染，使其具有了对裸鼠的致瘤特性；③有的肝癌细胞可能存在亚型，如国外有的作者使用的Li-7细胞形态与本研究所用细胞形态不同，表现出致瘤性不一。

同种肿瘤的不同细胞系代表了这种肿瘤的不同特性，它们之间在某些特性上可能存在差异，正如肝母细胞瘤和肝内胆管癌，它们同属于肝癌，是肝癌的不同亚型，但它们在临床表现和治疗上均有差异，同时本研究结果显示，HepG2、Li-7和Bel-7402三种肝癌细胞注射到裸鼠皮下后，在裸鼠血清中出现不同的微量蛋白表达，说明在不同细胞类型肝癌的早期诊断中应采用不同的肿瘤标志物，以提高临床肝癌早期诊断的特异性。

SELDI-TOF-MS是蛋白组学研究的一种新技术，尚处在发展阶段，尤其检测过程的标准化、如何解决激光的衰减给结果带来的影响等还需进一步完善，但其为我们筛选疾病的早期诊断指标提供了新思路，具有高通量、高灵敏度的特点，不仅可作为筛选指标诊断疾病的工具，亦是重要的科研手段。本研究所获得的这些差异蛋白，很有潜力成为疾病的筛选指标，特别有助于肿瘤疾病的早期诊断。

［1］Xia H，Chen J，Shi M，et al.The over-expression of survivin enhances the chemotherapeutic efficacy of YM155 in human hepatocellular carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（8）：5990-6000.

［2］Zeng X，Tao H.Diagnostic and prognostic serum marker of cholangiocarcinoma［J］.Oncol Lett，2015，9（1）：3-8.

［3］Li X，Zou K，Gou J，et al.Effect of baicalin-copper on the induction of apoptosis in human hepatoblastoma cancer HepG2 cells［J］. Med Oncol，2015，32（3）：72.

［4］周薇，戴奇刚，邓鑫，等.EGCG对人肝癌细胞株HepG2裸鼠移植瘤COX-2、VEGF和bFGF表达的调控［J］.中山大学学报（医学科学版），2013，34（3）：364-370.

［5］于卉，陶华林.肝癌实验室诊断的研究进展［J］.泸州医学院学报，2013，36（3）：305-307.

［6］常林，杨瑞丽.肝癌实验室诊断研究进展［J］.生物技术通讯，2010，21（1）：136-138.

［7］罗福东，丁海明.肿瘤标志物联检对原发性肝癌诊断的研究进展［J］.国际医药卫生导报，2010，16（1）：122-124.

［8］李军，李福涛，开丽，等.采用HepG2细胞株建立裸鼠肝癌模型的方法［J］.四川生理科学杂志，2002，24（2）：80-81.

［9］Genda T，Sakamoto M，Ichida T，et al.Cell motilitymediated by rho and Rho-associatedprotein kinase plays a critical role in intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol，1999，30（4）：1027-1036.

［10］Takamura M，Sakamoto M，Genda T，et al.Inhibition of Intrahepatic Metastasis of Human HepatocellularCarcinoma by Rho-Associated Protein Kinas Inhibitor Y-27632［J］.Hepatol，2001，33（3）：577-581.

［11］陶华林，汪碧琼，杨洋.SELDI-TOF-MS技术对鼻咽癌裸鼠移植模型早期蛋白组学研究［J］.现代检验医学杂志，2009，24（5）：21-25.

Expression of microproteins in nude mice injected with hepatoma cell lines of HepG2，Bel-7402 and Li-7

ZENG Xiaojun，TAO Hualin，WANG Biqiong，YU Hui
（The Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000，China）

Objective To investigate the serum proteinogram of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）which grow in the nude mice in order to find the microprotein markers which are associated with early diagnosis of hepatoma.Methods We classified 40 BALB/cA-nu nude mice into 4 groups randomly and marked them as HepG2 group，Li-7 group，Bel-7402 group and control group，respectively.Three types of hepatoma cell lines（HepG2，Bel-7402 and Li-7）were cultured and the cells were prepared into cell suspension（1.5×107/ml），respectively.We injected the cell suspension into the relevant groups with 0.2 mL in every mouse and the control group was injected with RPMI1640 medium. These nude mice were observed for 2 months and we got their blood on the 20th，40th，60th day by eyeball extirpating.We detected the proteinogram using surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry（SELDI-TOFMS）and then，we analyzed the data by Ciphergen ProteinChip 3.0 and Ciphergen Biomaker Wizard 3.1 and SPSS 16.0 to screen the differentiated proteins.Results After the mice in HepG2 group were injected with cell line HepG2，there were 29 differentiated proteins.Among them，8 proteins changed significantly and 5 proteins were up-regulated and 3 were downregulated.After the mice in Li-7 group were injected with cell line Li-7，there were 12 differentiated proteins.Among them，7 proteins enhanced，and 5 proteins weakened.After the mice in Bel-7402 group were injected with cell line Bel-7402，there were 5 differentiated proteins.Among them，4 proteins enhanced and 1 protein weakened.Conclusions Different subtypes of hepatoma cell lines injecting into nude mice can express different microproteins in the serum of mice. These proteins could be identified and detected to be promising markers of different subtypes of hepatoma for the early diag-nosis.

liver neoplasms；surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry；proteomics；differential protein；mass-to-charge ration；nude mice

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.002

R735.7

A

1002-266X（2016）25-0005-03

四川省科技支撑计划项目（2013JY0102）。

曾小峻（1989-），女，技师，主要研究方向为肿瘤分子诊断。E-mail：393461933@qq.com

简介：陶华林（1964-），男，主任技师，主要研究方向为肿瘤蛋白组学。E-mail：lzyxyjyx@163.com

2016-01-22）