靶向RAS信号通路的抗肿瘤药物治疗

何勤思综述　钟　军　郑　智审校



靶向RAS信号通路的抗肿瘤药物治疗

何勤思综述钟军郑智审校

肿瘤；RAS/RAF/MEK信号通路；靶向药物治疗

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.07.056

RAS蛋白(KRAS,NRAS,和HRAS)属GTPases蛋白超家族一员，可作为分子开关激动下游RAF蛋白激酶(BRAF,CRAF,和ARAF)。而RAF蛋白激酶中重要的底物是MAPK/ERK激酶(MEK1，MEK2)。MEK激酶只有一个主要的细胞外信号调节激酶(ERK)，因此，使用磷酸化的ERK激酶则可鉴别小分子药物是否能抑制RAS/RAF/MEK/ERK通路的信号传导[1]。激活ERK激酶可在转录因子调控下，控制细胞周期进展、分化、蛋白质合成、代谢、细胞存活、细胞迁移、入侵和衰老，甚至ERK激酶的激活可以使正常细胞获得许多肿瘤细胞的特征[2]。因此，靶向RAS信号通路治疗是战胜肿瘤的重要途径。

1　肿瘤中RAS基因突变

RAS癌基因是人类肿瘤中最常见的癌基因，RAS基因突变后编码的RAS蛋白阻止GTP向GDP转化,导致细胞中RAF激酶的构成性激活[3]。据估计,大约30%的人类癌症包含这样的突变,全球每年因RAS基因突变而导致癌症的病例超过300万人。突变RAS与其他突变基因一起可以使正常细胞完全转化为肿瘤细胞[4]。因此，靶向RAS蛋白一直是抗肿瘤药物研制的重点。RAS基因突变在血液肿瘤和实体瘤中非常常见：肿瘤细胞起源不同，则表现不同突变型的RAS蛋白亚型。例如,突变型NRAS蛋白在恶性血液病和黑色素瘤中占优势，而突变型KRAS蛋白多存在于结直肠癌和肺癌，其具体原因尚不清楚，推测与不同的细胞类型蛋白亚型的表达水平有关，或者从依赖细胞类型的方式来说与每种蛋白亚型激活下游信号能力的强弱有关。最常见的RAS基因突变的肿瘤是胰腺癌(90%)、结肠直肠癌(40%)、非小细胞肺癌(30%)、膀胱癌(30%)、腹膜癌(30%)、胆管癌(25%)、黑色素瘤(15%)，相比之下,淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、肝癌、骨肉瘤,前列腺癌中通常较少包含RAS基因突变。

对于RAS突变引起的肿瘤疾病的治疗，依赖于对RAS信号有关的RAF、MEK、ERK激酶的研究，因为RAS可以激活其他信号通路，如果这些激酶并不是RAS信号通路重要的组分，那么仅仅靶向RAS下游通路中RAF、MEK、ERK激酶是无用的。研究发现,在缺失RAS基因的细胞中通过激活MEK激酶可修复细胞的增殖缺陷，说明MEK激酶和ERK激酶是RAS信号的关键组件，类似的研究也涉及RAS信号通路中ERK下游分子如细胞周期素依赖性激酶,细胞周期的关键调节因子[5]；因此,抑制MEK激酶可以实现抗RAS突变肿瘤的作用[6]，而且临床前研究表明抑制CDK4是靶向RAS突变肿瘤的一种方法[7]。早期临床数据是鼓舞人心的，MEK激酶抑制剂如曲美替尼(trametinib)、抗黑色素瘤药物Cobimetinib、Pimasertib和MEK-162均表明具备抗RAS突变肿瘤的活性[8]。虽然MEK激酶抑制剂剂量的增加受限于皮肤和胃肠道的毒性,但是这些临床研究支持MEK作为RAS突变癌细胞细胞效应的下游关键调节者。

2　肿瘤中BRAF基因的突变

BRAF突变为治疗肿瘤提供了新的方向[9]，6%的人类癌症包含BRAF基因激活突变[9],全球每年因BRAF基因突变而诊断为癌症的病例超过500，000人。与RAS基因突变相似,BRAF基因突变与其他基因联合作用能将正常细胞转化为肿瘤。与RAS不同，RAS-GTP酶往往不能成功被小分子直接靶向，但靶向BRAF蛋白激酶的抑制剂包括维罗非尼(vemurafenib)[10]、达拉菲尼(dabrafenib)[11]、新的抗黑色素瘤药物LGX818显示出了较好的临床疗效。尽管在许多细胞中检测到异构体CRAF表达，但CRAF的突变极其罕见。这种现象可能与BRAF、CRAF激酶作为单体或二聚体功能活性的结构上的差异有关。BRAF的突变作为一个单体能强烈激活下游信号传导，CRAF没有这个属性。然而,CRAF是信号通路的一个重要组成部分,在RAS和上游细胞表面分子调控信号中起重要作用。BRAF被单一氨基酸置换激活最常见，但也可以与其他蛋白质易位后导致有活性的融合蛋白。该融合蛋白在对毛细胞型星形细胞瘤[12]和spitzoid样黑色素细胞肿瘤[13]研究中已经被叙述。不同的点突变导致BRAF基因第600位左右缬氨酸发生氨基酸置换后激活了此激酶的活性，当野生型BRAF细胞上游通路被激活时，通常产生一个抗反馈抑制的激酶的发生[14]。到目前为止BRAF基因最常见的突变是600位的缬氨酸置换为谷氨酸，在黑色素瘤中BRAF基因突变占85%以上，在非小细胞肺癌占50%以上，在结直肠癌、胆管癌、毛细胞白血病占95%以上。低突变活性在各种恶性肿瘤包括黑色素瘤、肺癌,前列腺癌中已被述及,但这些突变型蛋白依赖MEK/ERK激活MEK/ERK的信号通路诱导下一步反应的发生仍有待考察[15]。

正如RAS基因突变的细胞依赖MEK激酶,细胞中BRAF基因正常活性突变和BRAF基因高活性突变(V600E)依赖于与细胞生存和增殖有关的MEK和ERK激酶信号，这已在临床试验中得到验证：随机分配BRAF V600E基因突变的黑色素瘤患者分别使用MEK激酶抑制剂曲美替尼或化疗药物达卡巴嗪[16]，使用了曲美替尼的患者出现了明显的肿瘤缩小，证明BRAF基因突变(V600E)的肿瘤生存依赖MEK激酶，而使用MEK激酶抑制剂提高了肿瘤患者的疗效。但进一步的实验发现，曲美替尼缓解率(22%)明显低于BRAF激酶抑制剂维罗非尼、达拉菲尼胶囊、新的抗黑色素瘤化合物LGX818的缓解率(40%～60%)[16-17]，原因可能是该药副作用限制了临床使用剂量，达不到有效抑制MEK激酶活性的剂量。而BRAF激酶抑制剂可以提高到一个抑制BRAF激酶的剂量，可以有效抑制肿瘤下游的MEK和 ERK的信号传导。

3　靶向RAS/RAF/MEK通路的治疗

虽然目前BRAF激酶抑制剂(维罗非尼和达拉菲尼)和MEK激酶抑制剂(曲美替尼)已被FDA批准治疗BRAF基因突变的黑色素瘤，但一些关键问题和挑战仍然存在。首先是RAS突变的患者能否获得有意义的临床疗效：第一代MEK激酶抑制剂治疗RAS突变的肿瘤缓解率小于10%[6]；第一代RAF激酶抑制剂索拉非尼(2型抑制剂)，也不具备显著的抗RAS突变肿瘤活性。与新一代的RAF激酶(1型抑制剂)相比，索拉非尼实际上可能会促进RAS突变细胞信号传导[18]，因此,它显然是不足以抑制RAS突变肿瘤细胞的信号通路。目前ERK激酶抑制剂仍在进行临床实验，鉴于MEK和ERK在信号传导之间的关系，ERK激酶抑制剂是否能提高到充分抑制ERK激酶的活性的剂量并且没有显著毒性以便治疗RAS基因突变肿瘤患者可能是一个挑战。联合治疗可能是充分抑制RAS突变的细胞和肿瘤通路最好的方法。

另一个关键问题是当其它上游组件的信号被激活，比如说酪氨酸激酶受体或G蛋白偶联受体，RAS这条通路是否能被抑制。这些受体激活其他信号通路，最显著的是G蛋白偶联受体可以激活PI3K/AKT/mTOR或蛋白激酶C信号通路，在这种情况下，需要抑制多条信号通路[19-20]。迄今为止，既能抑制多条信号通路又不对正常细胞产生毒性的剂量还不确定。早期临床结果表明，MEK激酶和PI3K激酶抑制剂的联合使用由于其显著毒性所以没有令人满意的临床疗效[21]。

4　由BRAF激酶抑制剂导致的RAS/RAF/MEK 通路特殊激活作用

靶向RAS/RAF/MEK途径是困难的，因为随着剂量的递增正常组织中毒性也增加，但1型BRAF激酶抑制剂比如：维罗非尼和达拉菲尼可以达到很好疗效的剂量，原因是这些化合物一方面能够强有力地抑制突变BRAF基因所表达的蛋白的活性,另一方面也可以激活正常细胞中依赖RAF的信号传导[22-23]。因此,这些化合物展示了药物抑制信号传导的一个理想属性:在肿瘤细胞中强有力的抑制信号传导但不会抑制正常细胞中的信号传导。1型BRAF激酶抑制剂可以激活正常细胞中MEK和ERK的信号，导致对低增生的正常细胞缺乏毒性，而提升了对过度增生的肿瘤细胞的毒性反应[10,24-25]。

5　癌症治疗的未来展望:靶向RAS信号通路

BRAF突变黑色素瘤中对BRAF抑制剂获得性耐药最常见的机制是获得性新基因事件，即通过激活NRAS基因突变，放大的BRAF基因，使截短型BRAF基因的表达增加，最终由MEK新突变使肿瘤细胞的MEK和ERK恢复信号传导[26-27]。而通过更有效的靶向通路，可逆转该获得性耐药机制：联合运用1型BRAF激酶抑制剂和MEK激酶抑制剂如达拉菲尼+曲美替尼，维罗非尼+cobimetinib，LGX818+MEK162能较好地抑制该信号通路。对单一药物BRAF激酶抑制剂获得性耐药的患者，达拉菲尼+曲美替尼和维罗非尼+cobimetinib的联合运用均表明有抗获得性耐药的作用。如达拉菲尼加上曲美替尼已被证明是优于曲美替尼单药治疗，推迟肿瘤耐药性的出现,使肿瘤患者的PFS从5.8个月延长至9.4个月[28]，并已被FDA所批准。值得关注的是：达拉菲尼和曲美替尼联合运用的毒性似乎比单药达拉菲尼毒性更低[28]，表明通过特殊激活作用抑制下游MEK激酶的激活将维持正常细胞的信号转导，同时也可以降低毒性。

BRAF抑制剂获得性耐药的患者最常见的与激活通路的突变是获得性NRAS基因突变，可以通过CRAF信号传导激活ERK[29-31]。在这个环节中添加MEK抑制剂，通过直接抑制MEK作用减少MEK和ERK的激活，也可能会影响反馈途径来减少信号传导。所以，RAF和MEK抑制剂的联合使用可能有抗RAS突变肿瘤作用[32]。

另一靶向突变RAS的方法旨在抑制RAS激活的多种途径，如MEK抑制剂和PI3K抑制剂的联合运用[33-34]。然而这个方法具有挑战性是因为与BRAF和MEK抑制剂联合使用相比，此方法毒性更大。而BARF和MEK抑制剂联合使用的毒性就比单独用BRAF抑制剂毒性小。BRAF抑制剂中的特殊激活现象是通过抑制下游的MEK直接靶向，对正常细胞中具有广泛功效的PI3K和MEK通路之间的交叉干扰作用有一定限制。尽管如此，与正常细胞相比，RAS突变的细胞对联合抑制这些途径可能更敏感，所以联合治疗的方法仍然值得进一步关注。

随着靶向肿瘤细胞RAF/MEK/ERK通路信号传导治疗的精准医学战略快速发展，从根本上改变了治疗癌症的方法，虽然对于RAS突变的肿瘤患者仍是临床肿瘤治疗的一大难题，但靶向BRAF突变的肿瘤治疗已取得重大的进展，针对BRAF突变的肿瘤治疗不仅能更有效地降低化疗药物的毒性，提高疗效，同时也使我们把更多的目光投向靶向RAF/MEK/ERK通路的药物开发和临床治疗研究。

[1]Yoon S,Seger R.The extracellular signal-regulated kinase:multiple substrates regulate diverse cellular functions〔J〕.Growth Factors,2006,24(1):21-44.

[2]Scheid MP,Schubert KM,Duronio V.Regulation of bad phosphorylation and association with Bcl-x(L) by the MAPK/Erk kinase〔J〕.J Biol Chem,1999,274(43):31108-31113.

[3]Diaz-Flores E,Shannon K.Targeting oncogenic Ras〔J〕.Genes Dev,2007,21(16):1989-1992.

[4]Bos JL.Ras oncogenes in human cancer:a review〔J〕.Cancer Res,1989,49(17):4682-4689.

[5]Drosten M,Dhawahir A,Sum EY,et al.Genetic analysis of Ras signalling pathways in cell proliferation,migration and survival〔J〕.EMBO J,2010,29(6)29:1091-1104.

[6]Solit DB,Garraway LA,Pratilas CA,et al.BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition〔J〕.Nature,2006,439(7074):358-362.

[7]Kwong LN,Costello JC,Liu H,et al.Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma〔J〕.Nat Med,2012,18(10):1503-1510.

[8]Grimaldi AM,Simeone E,Ascierto PA.The role of MEK inhibitors in the treatment of metastatic melanoma〔J〕.Curr Opin Oncol,2014,26(2):196-203.

[9]Davies H,Bignell GR,Cox C,et al.Mutations of the BRAF gene in human cancer〔J〕.Nature,2002,417(6892):949-954.

[10]Flaherty KT,Puzanov I,Kim KB,et al.Inhibition of mutated,activated BRAF in metastatic melanoma〔J〕.N Engl J Med,2010,363(9):809-819.

[11]Falchook GS,Long GV,Kurzrock R,et al.Dabrafenib in patients with melanoma,untreated brain metastases,and other solid tumours:a phase 1 dose-escalation trial〔J〕.Lancet,2012,379(9829):1893-1901.

[12]Jones DT,Kocialkowski S,Liu L,et al.Tandem duplication producing a novel oncogenic BRAF fusion gene defines the majority of pilocytic astrocytomas〔J〕.Cancer Res,2008,68(21):8673-8677.

[13]Wiesner T,He J,Yelensky R,et al.Kinase fusions are frequent in Spitz tumours and spitzoid melanomas〔J〕.Nat Commun,2014,5:3116.

[14]Lito P,Pratilas CA,Joseph EW,et al.Relief of profound feedback inhibition of mitogenic signaling by RAF inhibitors attenuates their activity in BRAFV600E melanomas〔J〕.Cancer Cell,2012,22(5):668-682.

[15]Wan PT,Garnett MJ,Roe SM,et al.Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF〔J〕.Cell,2004,116(6):855-867.

[16]Flaherty KT,Robert C,Hersey P,et al.Improved survival with MEK inhibition in BRAF-mutated melanoma〔J〕.N Engl J Med,2012,367(2):107-114.

[17]McArthur GA,Chapman PB,Robert C,et al.Safety and efficacy of vemurafenib in BRAF and BRAF mutation-positive melanoma(BRIM-3):extended follow-up of a phase 3,randomised,open-label study〔J〕.Lancet Oncol,2014,15(3):323-332.

[18]Arnault JP,Mateus C,Escudier B,et al.Skin tumors induced by sorafenib;paradoxic RAS-RAF pathway activation and oncogenic mutations of HRAS,TP53,and TGFBR1〔J〕.Clin Cancer Res,2012,18(1):263-72:263-272.

[19]Cully M,You H,Levine AJ,et al.Beyond PTEN mutations:the PI3K pathway as an integrator of multiple inputs during tumorigenesis〔J〕.Nat Rev Cancer,2006,6(3):184-192.

[20]Wu X,Li J,Zhu M,et al.Protein kinase C inhibitor AEB071 targets ocular melanoma harboring GNAQ mutations via effects on the PKC/Erk1/2 and PKC/NF-kappaB pathways〔J〕.Mol Cancer Ther,2012,11(9):1905-1914.

[21]Shimizu T,Tolcher AW,Papadopoulos KP,et al.The clinical effect of the dual-targeting strategy involving PI3K/AKT/mTOR and RAS/MEK/ERK pathways in patients with advanced cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2012,18(8):2316-2325.

[22]Heidorn SJ,Milagre C,Whittaker S,et al.Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF〔J〕.Cell,2010,140(2):209-221.

[23]Poulikakos PI,Zhang C,Bollag G,et al.RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF〔J〕.Nature,2010,464(7287):427-430.

[24]Su F,Viros A,Milagre C,et al.RAS mutations in cutaneous squamous-cell carcinomas in patients treated with BRAF inhibitors〔J〕.N Engl J Med,2012,366(3):207-215.

[25]Oberholzer PA,Kee D,Dziunycz P,et al.RAS mutations are associated with the development of cutaneous squamous cell tumors in patients treated with RAF inhibitors〔J〕.J Clin Oncol,2012,30(3):316-321.

[26]Pratilas CA,Taylor BS,Ye Q,et al.(V600E)BRAF is associated with disabled feedback inhibition of RAF-MEK signaling and elevated transcriptional output of the pathway〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(11):4519-4524.

[27]Malumbres M,Barbacid M.RAS oncogenes:the first 30 years〔J〕.Nat Rev Cancer,2003,3(6):459-465.

[28]Flaherty KT,Infante JR,Daud A,et al.Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations〔J〕.N Engl J Med,2012,367(18):1694-1703.

[29]Wagle N,Van Allen EM,Treacy DJ,et al.MAP kinase pathway alterations in BRAF-mutant melanoma patients with acquired resistance to combined RAF/MEK inhibition〔J〕.Cancer Discov,2014,4(1):61-88.

[30]Shi H,Moriceau G,Kong X,et al.Melanoma whole-exome sequencing identifies(V600E)B-RAF amplification-mediated acquired B-RAF inhibitor resistance〔J〕.Nat Commun,2012,3:724.

[31]Nazarian R,Shi H,Wang Q,et al.Melanomas acquire resistance to B-RAF(V600E) inhibition by RTK or N-RAS upregulation〔J〕.Nature,2010,468(7326):973-977.

[32]Hatzivassiliou G,Haling JR,Chen H,et al.Mechanism of MEK inhibition determines efficacy in mutant KRAS-versus BRAF-driven cancers〔J〕.Nature,2013,501(7466):232-236.

[33]Engelman JA,Chen L,Tan X,et al.Effective use of PI3K and MEK inhibitors to treat mutant Kras G12D and PIK3CA H1047R murine lung cancers〔J〕.Nat Med,2008,14(12):1351-1356.

[34]Kinross KM,Brown DV,Kleinschmidt M,et al.In vivo activity of combined PI3K/mTOR and MEK inhibition in a Kras(G12D);Pten deletion mouse model of ovarian cancer〔J〕.Mol Cancer Ther,2011,10(8):1440-1449.

(编辑：甘艳)

国家自然科学基金项目(编号：81303119)；江西省卫生厅科技计划项目(编号：2012A083)

334000 南昌大学医学院(何勤思)；330029 江西省肿瘤医院(钟军,郑智)

郑智

R730.53

B

1001-5930(2016)07-1216-03

2015-09-01

2016-01-25)