MicroRNA:潜在的腹膜纤维化诊断标记物及治疗靶点

程慧栋 综述 俞雨生 审校

·腹膜透析·

MicroRNA:潜在的腹膜纤维化诊断标记物及治疗靶点

程慧栋 综述 俞雨生 审校

腹膜透析(PD)是终末期肾脏病(ESRD)患者的主要治疗方式之一，但长期PD容易出现多种并发症，其中腹膜纤维化(PF)是患者终止PD的主要原因。腹膜间皮细胞转分化(EMT)是PF的初始环节，近期研究表明microRNA介导了EMT，本文将针对microRNA在PF中的作用及展望进行综述。

腹膜纤维化 microRNA 腹膜透析

腹膜透析(PD)患者的腹膜长期接触生物不相容的腹膜透析液(PDF),致使腹膜纤维化(PF)进而超滤衰竭[1],在一定程度上限制了PD的长期及广泛应用，如何早期发现并积极预防PF是PD领域一个重大课题。近年来有研究表明，腹膜间皮细胞转分化(EMT)作为PF的早期和可逆环节在PF中起着非常重要的作用[2]。microRNA在EMT过程中的重要性越来越受到关注，已有研究证明靶向microRNA可有效逆转EMT并抑制多个器官(包括心脏、肝脏、肺、肾)的纤维化及系统性硬化等[3]。因此 microRNA可有望成为PF诊断标记物及治疗靶点。

MicroRNA简介

microRNA是由21～25个核苷酸分子组成的非编码RNA序列，通过多个不同mRNA之间的相互作用使翻译受阻或通过降解mRNA从而发挥调节基因的作用。实验表明microRNA参与调节细胞增殖分化的多个环节，包括进展、凋亡、DNA修复及多个器官系统的血管生成[4]。

最早期研究者在秀丽新小杆线虫(C.elegans)发现了microRNA，此后对其认识逐步加深[5]。大量疾病模型已证实在疾病发生发展过程中伴随microRNA的改变。microRNA控制大多数人类基因组中蛋白编码基因的表达，影响大多数生物化学通路介导的细胞内稳态。另外，一种microRNA可调节上百个目标mRNA的表达进而影响细胞表型和功能。microRNA在不同模型系统及体液中的研究进一步强调了其在疾病诊断和治疗中的潜在作用[6]。PD过程中异常的microRNA水平可能影响多个mRNA的表达，从而引起腹膜细胞生物学功能改变。

microRNA的命名依据其发现先后顺序和种属来源，规则如下[7]。动物和病毒：(1)microRNA成熟体简写成miR，再根据其物种名称及被发现的先后顺序， microRNA在数字后加上英文小写字母(a、b、c、……)，如miR-34a；(2)由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的microRNA，则在后面加上阿拉伯数字以示区分，如miR-199a-1；(3)microRNA的前体pre-miRNA其长度大约为70～80 nt，其形成发夹结构的两个臂都可能分别产生成熟的microRNA，在这种情况下则以microRNA的成熟体产生于pre-microRNA的5′端臂或3′端臂来命名，分别加上后缀“-5p”和“-3p”以区分，如miR-100b-5p和miR-100b-3p。植物microRNA命名与前述命名规则略有不同：(1)microRNA前体：以“MIR”取代“mir”命名顺序，且其后不跟有短线“-”，如MIR420；(2)microRNA成熟体：在“miR”与其后的数字(&字母等)编号之间有“-”，如miR-420。另外，所有种属均可将物种缩写置于miRNA 之前，如hsa-miR-195、asu-miR-100b-5p。

PD和PF的miRNA表达谱改变

前文已提及miRNA在大多数疾病中的表达出现异常。长期PD治疗极大影响腹膜细胞内稳态，致使腹膜细胞结构及功能发生改变，包括细胞百分比及表型的变化，这可能因受到某些特定miRNA表达谱的调控所致。Micro-样本分析技术的发展，人类腹膜的生物学结构和功能与鼠类极为相似，这两大优势使得研究者能够利用鼠PD模型开展体内研究进而分析PF时腹膜内miRNA变化情况[5]。

大鼠PD模型成功模拟出长期接受PD治疗的腹膜情况，相对经济、简便。通过每日向大鼠模型腹腔内注射4.25%葡萄糖造模发现，在腹膜功能受损的同时伴随着腹膜结构及形态学改变，包括腹膜增厚、大量胶原沉积、单核细胞浸润以及腹膜新生血管生成。造模4周后便可观察到腹膜间皮细胞(PMC)转化为成纤维细胞[8]。高渗透析组还可见α平滑肌蛋白(α-SMA)、胶原蛋白1(COL-1)等蛋白成分以及mRNA明显增加，表明PF进展。Lin等[8]发现与生理盐水及对照组相比，高渗透液组中8种miRNA(miR-31、miR-93、miR-100、miR-152、miR-497、miR-192、miR-194和miR-200b)显著下调，而miRNA-122表达增加，这些改变的miRNA也许与PF形成有关。

此外，Morishita等[9]发现与正常小鼠相比，PF小鼠腹膜上miRNA-21-5p明显增加。将抗-miRNA-21-5p锁核酸 (anti-miRNA-21-5p LNA，一种mi-RNA抑制剂)注入PF小鼠模型腹腔内，发现miRNA-21-5p增加受抑制，而其他几种miRNA不受影响，免疫荧光结果显示注射抗-miRNA-21-5p锁核酸抑制PF小鼠腹膜上α-SMA增加，证明注射抗-miRNA-21-5p锁核酸可抑制PF，阻止腹膜进一步增厚，并维持腹膜的功能。

microRNA与PF的关系

miRNA-200 近期发现miRNA-200家族(包括miR-200a、miR-200b以及miR-200c等)与多种纤维化疾病密切相关，在这些疾病过程中监测到 miRNA-200基因簇或单个基因的表达出现异常[10]。通过逆向调节其表达能在一定程度上抑制或减轻纤维化进展，表明miRNA-200也许是潜在的抗纤维化靶向药物。

Zhang等[11]纳入12例新置管与16例PD超过6月患者，证明PDF中的细胞主要为PMC，这些细胞在维持腹膜结构及功能上发挥重要作用。该实验发现新置管患者PDF中的PMC为圆形并混有上皮样细胞，PD初期在这种细胞中观察到PMC发生EMT。随着PD时间延长细胞的形态学改变越来越明显，PD超过6月组患者大部分PMC转变为纺锤丝样，且与新置管组相比，这些患者PDF中的钙黏附蛋白E降低，而波形蛋白、纤连蛋白及COL-1增加。PD初期当腹膜细胞仍为立方形时，钙黏附蛋白E、波形蛋白、纤连蛋白及COL-1已经改变，这暗示着EMT是PF的起始点。同时发现置管超过6月患者PDF中miRNA200c降低显著,说明miRNA200c也许参与了EMT及PF形成过程,过表达miRNA-200c很可能会抑制EMT。

miRNA-29 miRNA-29家族(包括miR-29a、miR-29b及miR-29c等)是目前发现的一种与多种纤维化疾病密切相关的小分子RNA家族[12]。最新研究表明，miRNA-29家族是转化生长因子β1(TGF-β1)介导的纤维化中最具特征的miRNA，它可预测并标记多个细胞外基质基因，如弹性蛋白(ELN)、原纤蛋白1(FBN1)、COL1A1、COL1A2和COL3A1。miRNA-29缺失促进心脏、肝脏和肺纤维化，已知miRNA-29是TGF-β1/Smad3基因的靶点，miRNA-29过表达抑制TGF-β1 /Smad3介导的心脏、肺以及肾脏纤维化[13]，TGF-β1 /Smad3信号通路在PF的形成过程中亦起到重要作用。Yu等[12]将PDF 注入PD小鼠模型腹腔14d内发现miRNA-29表达质粒通过超声微泡介导系统输送至腹膜，小鼠腹膜功能受损，miRNA-29明显降低。相反在PDF灌注之前过表达miRNA-29对PF有保护性作用，表明miRNA-29可抑制EMT，阻止腹膜功能紊乱。此外本实验发现直到PF 14天后再注入miRNA-29也能够在一定时间内阻止PF进展，阻断Sp1-TGF-β1/Smad3通路也许是miRNA-29抑制PF的机制。

miRNA-129-5p 已知miRNA-129-5p是肾脏纤维化潜在的TGF-β1下游抑制因子，但其在EMT中的作用尚不得知。Xiao等[14]通过miRNA序列分析、northern blot分析以及实时定量 PCR检测技术，证明与新置管组相比， PD超过6月患者PDF中miRNA-129-5p明显减少，且伴随EMT相关基因及各自蛋白的改变。体外实验发现，随着PMC内细胞迁移增加，钙黏附蛋白E及紧密连接蛋白1表达显著下降， EMT相关基因及蛋白的改变与miRNA-129-5p过表达呈负相关。最终证明Smad相互作用蛋白1(SIP1)能够抑制钙黏附蛋白E启动子活性而增强波形蛋白启动子活性， miRNA-129-5p通过直接标记SIP1的3′UTR从而抑制他们转录后活性。

周循[15]发现，5ug/L外源性TGF-β1可使人PMC的miRNA-129-5p表达明显降低，呈时间依赖性。pre-miRNA-129-5p预转染可恢复TGF-β1诱导的上皮标志物钙黏附蛋白E及mRNA的表达，并抑制TGF-β1诱导的SIP1作用的间质标志物波形蛋白表达；与TGF-β1刺激组比较，过表达miRNA-129-5p可明显抑制TGF-β1诱导的SIP1蛋白表达，而对mRNA无影响。因此，miRNA-129-5p可能参与PD患者PMC的EMT，并可能通过转录后调控SIP1参与该过程，以TGF-β1/miRNA-129-5p/SIP-1作为靶点有望为PF及EMT防治提供新途径。

miRNA-30

miRNA-30a Zhou等[16]发现无论是PD患者还是PD小鼠模型PF均呈持续进展状态，伴随腹膜组织中miRNA-30a下降。体外实验TGF-β1诱导的EMT中，α-SMA从头合成，钙黏附蛋白E丢失，这可能与miRNA-30a下调、转录因子snail1上调有关，表明TGF-β1诱导的PF与miRNA-30a和snail1联系密切。体外实验证实，miRNA-30a能够连接到snai1的3′非编码区，而miRNA-30a过表达可阻断TGF-β1诱导的snai1上调，抑制EMT和胶原表达。小鼠模型腹膜组织中过表达miRNA-30a可阻断snai1及EMT，抑制PF并改善腹膜功能。

miRNA-30b PD过程PMC 的EMT发生原因之一是由于长期接触葡萄糖降解产物如丙酮醛。Liu等[17]为探寻miRNA-30b在丙酮醛诱导PMC EMT中的作用，向PD大鼠模型腹腔内注射丙酮醛进而观察miRNA表达变化情况，发现在上调的miRNA中，miRNA-30b变化较为显著。向腹腔内注射miRNA-30b化学修饰的反义RNA寡核苷酸(ASO)2周后，α-SMA分泌显著减少，钙黏附蛋白E和骨形成蛋白7(BMP-7)表达增加，表明丙酮醛诱导的大鼠PMC EMT改善。骨形成蛋白7是TGF-β1超家族的一种，可负向调节EMT并阻止纤维化[18]。运用生物信息分析技术发现，骨形成蛋白7 mRNA的3′非编码区含有miRNA-30b结合位点。注射丙酮醛 4周后，骨形成蛋白7下降显著，而注射miRNA-30b ASO后发生相反的变化，最终证实miRNA-30b通过直接标记PMC中骨形成蛋白7从而参与丙酮醛诱导的大鼠PMC EMT[17]。

miRNA-589 Zhang等[19]观察到无论在长期PD患者还是TGF-β1刺激后的鼠PMC中，miRNA-589表达均下降。体外实验发现TGF-β1可诱导的PMC中波形蛋白上调，紧密连接蛋白和钙黏附蛋白E下调，表明 EMT开始。在TGF-β1刺激后的PMC中，这些变化伴随着显著的miRNA-589下降。通过转染pre-miRNA-589可部分逆转EMT。

基于以上实验结果，有理由相信miR-200、miR-29b、miR-129-5p、miR-30、miR-589等miRNA有希望成为诊断PD相关PF的新型标记物及治疗靶点。所以，研究出合适有效的实验及检测方法能够帮助我们及早发现并逆转PF，帮助患者持续有效进行PD治疗，从而提高 PD患者透析质量。

利用生物标记物早期诊断PF

腹膜活检是目前诊断PF的唯一有效方法，但由于其有创性而且取到腹膜标本较困难，其应用有限[20]。因此，我们迫切需要一种简单、非侵入性、特异且敏感的方法来检测PF。PDF是分析的理想来源，它也是临床上运用最频繁的标本，通过监测其容积变化情况，并分析PDF生物化学及细胞学变化情况，临床医生能够有效评估PD患者透析状态。探寻PDF中的特异生物标志物成为检测PF的新型且有效方法[21]。

CA-125和IL-6是PDF生物标记物中研究最多的分子，但因个体内与个体间的变化使得他们很难成为可靠的生物标记物[22]。PDF中含有多种腹膜细胞及白细胞来源的大分子、蛋白、RNA，这些都可以作为潜在的腹膜生物标记物。已有多个领域展现miRNA可成为潜在的生物标记物，而且它们在不同的体液中监测起来都比较容易[23]。PDF来源的miRNA其表达形式特殊、易检测、稳定并且可靠，是生物标记物的最佳选择。

传统分离及培养人PMC的实验方法实施较困难，而近期研究者通过从PDF中成功地培养和分离出PMC，它准确地反应了腹膜细胞的功能，并可用来分析钙黏附蛋白E、波形蛋白、 纤连蛋白及COL-1的表达变化情况。这是一种有效的研究PD患者PMC表型及生理功能变化的方法，为阻止超滤衰竭提供了临床依据[24]。

目前检测miRNA存在的问题

关于PD中miRNA研究目前仍处在早期阶段，用其作为PD个体化的标志物仍然是一个临床难题。一些研究证实了miRNA在腹膜上的特殊作用，主要涉及到PMC的EMT。虽然体外实验及动物模型为检测miRNA提供了一些理论依据，但仍不能应用于临床，关于PDF样本来源的miRNA分析仍需要大量公正的多中心研究来证实，只有那样才能将miRNA生物标记物与PF治疗关联起来。

动物模型成功模拟PD患者，但其可实施性仍然受到诸多限制[25]。人类和动物体内miRNA序列并不总是保守的[26]，因此分析miRNA在人体内的相关性更加重要。Weber等[27]首次检出患者PDF上清液中miRNA，提出使用PDF作为分析miRNA原材料的可能，且这将有可能被用作生物标记物监测PD治疗。但事实上PD过程中液体交换的时间很短，而且PDF容积较大，使得监测患者PDF上清液中miRNA极为困难。

小结： miRNA在调节PMC表型及腹膜腔内稳态方面起到重要作用。通过监测PDF中的miRNA有望用于临床预测PF的发生。为了尽早证实miRNA成为PF诊断标记物及治疗靶点，我们仍需大量基础实验及临床研究的合作，进而为实践提供更多有力依据从而将miRNA成功运用于临床。

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(本文编辑 逸 沐)

MicroRNA， a potential marker for diagnostic and therapy of peritoneal dialysis patients with peritoneal fibrosis

CHENGHuidong，YUYusheng

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

Peritoneal dialysis is one of the main treatments for end stage renal disease, but long-term peritoneal dialysis prone to a variety of complications, in which peritoneal fibrosis is the main reason for such patients out of peritoneal dialysis. Peritoneal epithelial-mesenchymal transition(EMT)prove to be initial step of peritoneal fibrosis, recent studies have shown that microRNA mediated EMT, therefore this article will review on the role of microRNA in peritoneal fibrosis and its prospect.

peritoneal fibrosis microRNA peritoneal dialysis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.04.017

南京大学医学院附属金陵医院(南京军区南京总医院)肾脏科硕士研究生(程慧栋) 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)

2016-05-30