外泌体在疾病诊治作用中的研究进展

梁玲，李胜活，陈子梦（广州医科大学附属第四附医院，广州510000）

外泌体在疾病诊治作用中的研究进展

梁玲，李胜活，陈子梦
（广州医科大学附属第四附医院，广州510000）

外泌体（Exosomes）是囊泡转运的主要组成部分之一，囊泡转运对于细胞发挥多种功能活动起重要作用。释放至细胞外面的Exosomes参与一系列生物过程，如免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结过程、肿瘤转移、动脉硬化、抗原提呈和治疗受损器官等。诸多研究表明，不同细胞来源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白质来调节膜骨架的动态性及膜融合；另外，Exosomes中还包含核酸物质，统称为eRNA，Exosomes的生物学功能通过其携带蛋白质和miRNA等到达受体细胞而发挥调控作用。Exosomes可由树突状细胞、血小板、肥大细胞、内皮细胞间充质干细胞和肿瘤细胞等不同细胞类型分泌，并可在多数体液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等体液中检测到。诸多研究表明Exosomes携带的mRNA、miRNA和蛋白质在疾病发生发展过程中会发生明显变化，可作为疾病诊断的理想标记物。在Exosomes治疗疾病研究方面，目前比较关注的是骨髓间充质干细胞和树突状细胞来源Exosomes的治疗作用。

外泌体；肿瘤免疫；肿瘤血管新生；诊断；治疗

外泌体（Exosomes）是由多种细胞分泌的40～100 nm的膜性小囊泡，由细胞内多泡体（MVE）出芽形成，再与细胞膜融合后释放至细胞外基质中。细胞间的通讯可通过Exosomes携带mRNA、microRNA （miRNA）和蛋白质等到达受体细胞发挥调控作用。目前研究表明Exosomes携带的蛋白质、mRNA和miRNA与机体及细胞的生理疾病状态密切相关，是潜在的理想生物标志物。另外，干细胞分泌的Exosomes是干细胞发挥治疗作用的主要作用机制之一，树状突细胞的Exosomes还具有抗肿瘤免疫、促进肿瘤血管新生等生理功能。经过国内外科学家的努力，目前在Exosomes领域的研究取得较大进展。现将Exosomes在疾病诊治中的研究进展综述如下。

1 Exosomes的生物学特征

Exosomes是细胞分泌的一类40～100 nm的膜性小囊泡，是囊泡转运的主要组成部分之一。囊泡转运对于细胞发挥多种功能活动起重要作用，James等因发现细胞囊泡转运调控机制而获得2013年诺贝尔生理学医学奖［1］。在囊泡转运过程中，根据转运过程中所处的位置不同将囊泡分为早期内涵体（EE）、晚期内涵体（LE）和循环内涵体（RE）［2］。其中，晚期内涵体会形成多泡体，多泡体进一步分泌一类直径为40～100 nm的膜性囊泡——Exosomes［3］。释放至细胞外面的Exosomes参与一系列生物过程，如免疫应答、凋亡、血管生成、炎症反应、凝结过程、肿瘤转移、动脉硬化、抗原提呈和治疗受损器官等［4］。诸多研究表明，不同细胞来源的Exosomes，通常含有相同的一套蛋白质来调节膜骨架的动态性以及膜融合，这类蛋白如GTP酶的Rab家族、Alix、ESCRT蛋白、热休克蛋白、膜联蛋白等；另外，Exosomes中还包含核酸物质，统称为eRNA，Exosomes的生物学功能通过其携带蛋白质和miRNA等到达受体细胞而发挥调控作用［5］。Exosomes可由树突状细胞（DC）、血小板、肥大细胞、内皮细胞间充质干细胞和肿瘤细胞等不同细胞类型分泌，并可在多数体液如外周血、尿液、唾液、羊水、乳汁、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等体液中检测到［6］。诸多研究表明Exosomes携带的mRNA、miRNA和蛋白质在疾病发生发展过程中会发生明显变化，可作为疾病诊断的理想标记物。并且将Exosomes从体液中分离出来用于监测，显著降低了样品复杂性，有利于生物标志物的检出。因此，Exosomes为疾病诊断及标志物的探索提供了一个全新的思路和方向。不同细胞分泌的Exosomes会有不同的功能。在Exosomes治疗疾病研究方面，目前比较关注的是骨髓间充质干细胞（MSC）和DC来源Exosomes的治疗作用。

2 Exosomes中的miRNA对疾病的诊断作用

miRNA是一类长度为18～25 nt的小分子非编码小RNA，广泛存在于真核细胞中，能通过降解靶mRNA或抑制其翻译，调节细胞增殖、分化与凋亡，参与个体发育、机体代谢及肿瘤发生等。诸多研究已表明miRNA可作为肿瘤、肌肉损伤、炎症等多种疾病的生物标志物［7］。目前有学者发现miRNA可选择性组装到Exosomes中，然后稳定存在于患者的血液、尿液和其他体液中，更有意义的是miRNA数量和组成在患者和正常人中存在差异，与疾病的发生发展密切相关，可作为疾病诊断的理想标记物。

在肿瘤标记物研究方面，Huang等［8］发现Exosomes中的let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a与结肠癌的发生密切相关。Kawata等［9］发现Exosomes中的miR-1290、miR-375可作为去势难治性前列腺癌的诊断标记物。Riccardo和他的同事筛选肺癌和正常吸烟者血清Exosomes中的差异miRNAs，发现miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p可用于鉴定肺癌和正常吸烟者，另外，他们还发现miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p可用于区分肺腺癌和肺肉芽肿瘤患者［10］。有学者比较肿瘤和Exosomes中miR-17-3p、miR-21、miR-106a、miR-146、miR-155、miR-191、miR-192、miR-203、miR-205、miR-210、miR-212和miR-214的表达情况，发现肿瘤中的表达情况和Exosomes中的表达情况无统计学差异，即检测Exosomes中的差异miRNA可反映肿瘤实际情况，可作为肿瘤诊断标记物。Huang等［11］对前列腺癌患者血清中Exosomes 的RNA进行测序，发现在前列腺癌患者中miR-1290和miR-375呈高表达，且miR-1290和miR-375的表达与生存期密切相关。Cazzoli等［12］发现Exosomes中存在的差异miRNA分子和蛋白质可作为肺癌的筛查和诊断标记物，敏感性和特异性分别可达96.0%和76.0%。Roccaro等［13］通过microRNA芯片分析正常人骨髓间充质干细胞和多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞Exosomes的miRNA组成，发现miR-15a在多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的Exosomes中明显下调，并进一步探索发现他们与多发性骨髓瘤的特性密切相关。

在急性冠脉综合征研究方面，Kuwabara等［14］发现Exosomes中的miR-1和miR-133a在急性冠脉综合征患者中明显升高，可作为其检查的特异性标记物。有学者发现相对于正常人，心肌梗死患者尿液和血清Exosomes中miR-1和miR-208l的水平均明显升高。在肾脏病研究方面，Lv等［15］通过RT-PCR检测miR-29、miR-200在慢性肾病患者健康人尿液Exosomes中的表达情况，结果显示miR-29水平明显下降，ROC曲线结果显示AUC为0.902，提示MicroRNA-29c对慢性肾病有较高的诊断价值。Wang等［16］发现IgA肾病患者尿液Exosomes中的miR-200a、miR-200b和miR-429明显减少，进一步研究发现其减少的程度与疾病的严重程度呈负相关。Lv等［17］发现尿液Exosomes中的CD2AP mRNA是肾脏疾病的诊断标记物，他们分别收集了32例肾脏疾病患者和7例健康人的尿液，并分离Exosomes及其RNA，然后通过RT-PCR检测CD2AP、NPHS2和synaptopodin的mRNA水平，结果显示CD2AP mRNA水平在患者中明显下降，ROC曲线分析结果显示AUC值为0.821（P=0.008），说明Exosomes中的CD2AP mRNA对肾脏疾病的诊断有较高价值。

3 Exosomes中蛋白质对疾病的诊断作用

蛋白质组学是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科，是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。目前在Exosomes研究领域，可通过蛋白质组学全面分析Exosomes中蛋白质的组成，从而更加全面了解Exosomes的功能及作用靶点，同时对探索疾病的标记物有重要意义。

在肿瘤研究方面有学者通过蛋白质组学技术发现膀胱癌患者尿液Exosomes中存在的差异蛋白可用于膀胱癌的早期诊断，并且证实Exosomes中的差异蛋白和膀胱癌组织间存在高度相关性。Roccaro等［17］通过蛋白质组学分析正常人骨髓间充质干细胞和多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞的Exosomes蛋白质组成差异，发现IL-6、CCL2和fibronectin在多发性骨髓瘤患者骨髓间充质干细胞中明显上调，并进一步探索发现他们与多发性骨髓瘤的特性密切相关。

在其他疾病研究方面，有学者分别比较了帕金森患者和正常人尿液Exosomes中LRRK2或DJ-1的表达情况，发现在正常人和帕金森患者中差异不是很明显，但当按照性别分析时，发现在男性帕金森患者中的DJ-1表达情况有明显差异。有学者构建小鼠肝脏损伤模型，收集其尿液提取Exosomes进行蛋白质组学分析，发现28种未曾在Exosomes中报道过但与疾病密切相关的蛋白，其中Cd26、Cd81、Slc3A1和Cd10可作为肝脏损伤的标记物。有学者分别检测HIV阳性患者血清Exosomes和无Exosomes血清中21个细胞因子和趋化因子的表达情况，发现大部分细胞因子在HIV阳性患者血清Exosomes中的相对表达量明显升高，是HIV潜在的检测标记物。

4 MSC来源Exosomes对疾病的治疗作用

干细胞是一类未充分分化、具有自我更新、多向分化潜能的细胞，主要包括胚胎干细胞、诱导性多能干细胞等，它们为目前临床难以治疗的重大疾病提供了一种新的治疗方法［18，19］。其中MSC具有取材方便、应用广泛和免疫原性低等优点，是目前干细胞应用研究的热点［20，21］。至于MSC治疗疾病的机制，主要与其定向分化和旁分泌功能有关。有研究者发现从现在干细胞治疗的动物实验或临床试验观察到的获益主要来源于干细胞的旁分泌效应［22］，其中Exosomes是目前细胞旁分泌的主要研究热点，诸多研究已证实干细胞修复器官的功能与其分泌的Exosomes密切相关。既往多项研究发现，MSC培养上清可能是通过生长因子、细胞因子等旁分泌效应对损伤组织起修复作用［23］。

在肾脏损伤治疗方面，Bruno等［24］发现MSC来源的Exosomes对甘油诱导的SCID鼠急性肾损伤模型具有保护作用，其修复能力与其母体细胞无统计学差异。2011年该课题组通过进一步研究发现，MSC来源的Exosomes对缺血再灌注损伤诱导的非SCID SD大鼠急性肾功能损伤有保护作用，实验组血清中的BUN和Cr水平明显减低，差异有统计学意义。若预先用RNase处理Exosomes，虽然Exosomes的体积和表面黏附分子表达未发生变化，但Exosomes却失去了肾脏保护作用，这提示Exosomes的肾保护作用可能通过RNA实现。Wang等［25］研究发现，与缺血再灌注组相比，MSC处理的缺血再灌注组、MSC来源Exosomes处理的缺血再灌注组BUN水平明显下降、凋亡细胞明显减少、炎症因子水平明显下降。

在皮肤创面治疗方面，有学者构建了SD大鼠皮肤深Ⅱ度烧伤模型和体外皮肤细胞烧伤模型，然后用来源于MSC的Exosomes进行治疗，以肺成纤维细胞的Exosomes作为对照组，发现经MSC的Exosomes治疗后，SD大鼠皮肤深Ⅱ度烧伤模型的创面愈合率、细胞存活、上皮化情况和PCNA表达情况明显优于对照组。同样体外皮肤细胞烧伤模型的增殖情况、存活率和PCNA表达情况明显优于对照组。进一步研究发现，来源于骨髓间充质干细胞的Exosomes通过激活wnt4/β-catenin和AKT通路促进皮肤创面愈合。Zhang等［26］利用人诱导多能干细胞起源MSC的Exosomes注射于大鼠创面周围皮下，结果显示MSC的Exosomes可促进上皮化，减少痂皮宽度，促进胶原成熟、促进新生血管形成和促进创面成熟。同样，在体外试验发现人诱导多能干细胞起源MSC的Exosomes以剂量依赖方式刺激人真皮成纤维细胞和静脉内皮细胞增殖和迁移，另外，Ⅰ、Ⅲ型胶原和弹性蛋白分泌及mRNA表达亦随Exosomes浓度增加而增加。

在心肌梗死治疗方面，Feng等［27］发现经预缺氧的MSC可分泌携带有miR-22的Exosomes作用于心肌细胞的靶基因Mecp2从而保护心肌细胞，保护心肌缺血模型。在肝脏损伤治疗方面，Tan等［28］用来源于MSC的Exosomes和四氯化碳（CCl4）一起注射到小鼠中，发现Exosomes可减轻CCl4对肝脏的损害，进一步检测发现肝实质细胞的存活率和PCNA表达量明显优于对照组。说明在MSC修复靶器官过程中Exosomes旁分泌效应有重要作用。

5 DC来源Exosomes对疾病的治疗作用

DC是目前功能最强的抗原呈递细胞，能刺激初始型T细胞增殖，激发机体免疫应答。近年来，DC释放的有生物学活性的Exosomes引起了人们极大兴趣，其显示出呈递生物相关抗原、具有免疫治疗作用的特性。有研究发现成熟DC分泌的Exosomes （mDex）激活抗原特异性T细胞的能力比未成熟DC分泌的Exosomes（imDex）强，进一步比较其分子组成显示，与imDex相比，mDex含较丰富的B7.2、MFG-E8较少且几乎无FasL［29］。任亚娜等［30］发现DC来源的Exosomes可通过其表面分子引起T细胞免疫应答，他们通过实验阻断DC来源Exosomes上部分分子（CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83）后检测Exosomes免疫学功能，结果显示阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用。

综上所述，Exosomes的发现丰富了我们对细胞间通讯方式的认识，有利于加深我们对机体生理、病理过程的理解。目前对Exosomes的研究主要集中于疾病的标记物探索及对疾病的治疗作用上。但介导相应RNA和蛋白质进入Exosomes的转运信号机制仍不清楚，且Exosomes的分泌机制、融合机制亦需进一步研究，才能更好地将其利用于研究或临床应用中。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2016.25.038

R730

A

1002-266X（2016）25-0107-04

广州市属高校科研项目（1201430440）。

李胜活（E-mail：chrisleeone@qq.com）

2016-03-24）