羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的工业化生产及应用

曹　政，赵扬扬，林　雅，李春燕，刘晓竹，邓灿新（.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆荣昌40460；.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌40460）



羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的工业化生产及应用

曹政1，赵扬扬1，林雅1，李春燕1，刘晓竹1，邓灿新2
（1.重庆澳龙生物制品有限公司，重庆荣昌402460；2.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460）

摘要：本文对羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的工业化生产工艺及应用效果进行了研究，为有效防控包虫病在人畜间传播奠定了基础。

关键词：包虫病；基因工程亚单位疫苗；Eg85；工业化生产

棘球蚴病又称包虫病，是人和动物感染细粒棘球绦虫及多房棘球绦虫的幼虫所致的疾病。包虫病是严重危害人体健康和生命安全、影响畜牧业健康发展的重大人畜共患寄生虫病之一。世界动物卫生组织将其列为B类动物疾病，我国将其列为二类动物疫病和人兽共患病［1］。本文对羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的工业化生产及应用进行了研究，为包虫病的预防提供坚实的基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种本文所用菌种由重庆澳龙生物制品有限公司提供。

1.1.2试验羊只试验所用绵羊（240只）由新疆维吾尔自治区、内蒙古自治区某养殖场提供；试验用山羊（240只）由四川省甘孜州及阿坝州某养殖场提供。

1.1.3工艺辅料种子培养基及发酵培养基为LB培养基；包涵体洗液I、包涵体洗液II为自制；变性液为8mol尿素变性液。

1.2方法

1.2.1检测方法SDS-PAGE电泳检测目的条带，多联酶标仪测定总蛋白含量，BandScan软件分析目的蛋白含量，按照《中华人民共和国兽药典》（指2010版，下同）检测成品中水分含量、无菌效果、真空效果，完成安全检验及效力检验。

1.2.2检测标准羊棘球蚴（包虫）病基因工程亚单位疫苗的成品检测标准包括：外观检测成品应为乳白色疏松固体；蛋白纯度检测Eg85纯度应不低于60%，每头份成品中Eg85蛋白含量不少于50 μg，Quil A佐剂不少于1mg。疫苗整个生产过程应严格执行GMP相关标准，疫苗成品的真空度、水分残留、外源微生物都要符合《中华人民共和国兽药典》的要求。

2　具体生产工艺

2.1工业化生产车间重庆澳龙生物制品有限公司于2008年建成了世界上第一条包虫病疫苗生产流水线，产品于2011年投放市场，现已大规模生产和上市销售。

2.2发酵工艺

2.2.1一级种子制备取一支-80℃保存的工作种子，按1%分别接种于两份LB（Amp+、Chl）培养基，37℃振荡培养。培养至对数期时，转交于发酵生产线。

2.2.2二级种子制备取一瓶50mL生长于对数期的一级种子，按1%～2%接种于1.5 L LB（Amp+）培养基中，共接种8瓶，150r/min37℃振荡培养，培养过夜至饱和后，将二级种子收集在一起，放4℃暂存。

2.2.3高密度发酵在正式发酵前一天，按配方配制合成培养基，并在发酵罐中进行实消，保持罐压不低于0.03MPa。正式发酵时调节培养基温度至37℃，调节pH值在7.0。按比例加入终浓度为0.1%的Amp。接入二级种子，搅拌速度开至150r/min，初始罐压保持0.04 MPa，37℃培养发酵8～10h，当细菌生长进入对数后期时，添加终浓度为1mmol/L的IPTG，继续培养4～6 h，诱导蛋白表达，发酵完成后对菌体进行灭活。

2.3纯化工艺

2.3.1菌体初纯对已灭活菌体进行15000r/min离心，离心后菌体用1%NaCl重悬，通过高压均质机破碎细胞，破碎后通过管式连续离心机离心，收集菌体。

2.3.2菌体精纯提前配制精洗液I与精洗液II，破碎后包涵体用精洗液I重悬，常温搅拌1～2 h，搅拌结束后离心收集包涵体再用精洗液II重悬并搅拌1～2h，管式连续离心机离心，收集包涵体。

2.4半成品制备工艺

2.4.1包涵体变性将精洗后合格的包涵体按1﹕20比例用变性液重悬，在37℃条件下搅拌过夜。搅拌结束后用管式连续离心机离心去除杂质，离心后变性液用0.45nm与0.22nm孔径的超滤装置超滤，回流液残留用0.45nm与0.22nm平板滤器过滤。

2.4.2除菌过滤变性液经过滤后，继续用0.45nm 及0.22nm平板滤器在无菌条件下进行无菌过滤。过滤后的变性液送样检测是否存在杂菌，质量不达标则需重复操作。

2.4.3佐剂配制将Quli A佐剂用复性液配制成150mg/mL的佐剂母液，用平板滤器作无菌过滤。过滤后佐剂母液送样检测是否存在杂菌，若质量不达标则需重复操作。

2.5配苗分装工艺取半成品变性液及佐剂母液各一份，在搅拌条件下用无菌复性液快速复性，按照3.0mL/瓶进行分装配苗，分装完成的苗液需要冻干，冻干完成后进行压盖、贴标、装盒。

3　成品检测

3.1物理性状检验本疫苗成品应表现为白色海绵状疏松团块，加入稀释液后迅速溶解。

3.2真空度检验冻干、压盖后的成品应具有一定的真空度，按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行真空度测定，应为紫色光辉。

3.3剩余水分检验按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行测定，成品水分含量不得超过3.5%。

Industrial Production and Application of Hydatidosis Genetic Subunit Vaccine on Sheep

CAO Zheng1，ZHAO Yangyang1，DENG Canxin2，et al.
（1.Chongqing Auleon Biologicals Co.Ltd.，Chongqing Rongchang 402460；2.Department of Veterinary Medicine of Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing Rongchang 402460，China）

Abstract：This paper researched the industrial production technics and application effect of hydatidosis genetic subunit vaccine on sheep，it aimed at prevention and control hydatidosis spread between people and animals.

Key words：Hydatidosis；Genetic engineering subunit vaccine；Eg85；Industrial production

中图分类号：S858.272.734

文献标识码：B

文章编号：1001-8864（2016）05-0028-03

收稿日期：2016-03-28

基金项目：重庆市农业科技成果转化资金项目（cstc2015jcsf-ny cgzhA10002）

作者简介：曹政（1884-），男，内蒙古锡林浩特市人，研究员，博士，从事微生物分子生物学研究。