脑缺血小胶质细胞的表型转化与靶向治疗研究

方婷，陆林清，周达，易黎

·综述·

脑缺血小胶质细胞的表型转化与靶向治疗研究

方婷，陆林清，周达，易黎

炎症反应在脑缺血的发病机制中起重要作用。小胶质细胞（MG）是中枢神经系统的固有免疫细胞，脑缺血发生后MG可被迅速活化为M1、M2不同表型，参与炎症反应的发生及后期的组织修复等过程。MG的过度活化可导致一系列细胞毒性因子的累积，对参与MG激活过程中的受体、信号通路及分泌物等的调节都可能是一个新的治疗策略。临床前研究表明几类药物具有上述作用，本文主要从脑缺血损伤后MG的活化表型、作用及临床前研究中对靶向抑制MG激活的药物进行综述。

小胶质细胞；脑缺血；炎症反应；表型

脑卒中是人类的三大致死疾病之一，具有极高的致死率和致残率。目前，组织纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）仍是唯一为FDA批准可用于急诊溶栓的药物，但由于其有限的治疗时间窗及严重的并发症大大限制了临床应用[1]。因此，进一步探索新的脑缺血治疗药物迫在眉睫。

近期研究发现免疫系统各组分参与脑缺血级联反应的各阶段，包括脑缺血发生、脑实质损害及后期的组织修复重建。小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统的固有免疫细胞。脑缺血后MG的活化与神经炎症、血脑屏障破坏等密切相关。MG的活化受多种因素的精细调控，包括各种细胞因子、受体和蛋白等，而MG活化调控过程中的信号通路也成为治疗脑缺血药物的治疗靶点。近期研究基于转录特点、蛋白组学和功能的分析，认为MG可活化为M1型和M2型两种不同表型而发挥不同作用[2]。因此，深入研究MG不同活化表型在脑缺血损伤中的作用，将MG作为脑缺血后的靶体细胞，将为脑缺血损伤的临床治疗提供新思路。

1 脑缺血MG不同的活化表型及效应

正常脑组织中，静息状态下的MG可通过持续的收缩舒展运动以一定频率与神经元的突触接触，穿梭于脑实质内发挥监视作用。脑缺血损伤后MG可迅速激活，在形态学和功能上都发生明显改变；在早期的研究中采用流式细胞仪发现，脑缺血后缺血侧MG数量明显上升，对侧则保持在基础水平[3]。

近期研究表明，脑缺血后MG可向不同分子标记的经典激活的M1型和选择性激活的M2型两种不同表型转化，这种区别取决于刺激源的不同。M1型代表一种伤害性的MG状态，可高表达促炎介质（包括IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、IFN-γ等）推进脑缺血的病理过程，加重脑损害。相反，M2型可通过分泌抗炎介质及生长因子（包括IL-4、IL-10、TGF-β、IGF-1等），对延长神经元的生存及限制缺血性脑损伤起重要作用[4]。此外，缺血后一系列转录因子的表达改变及相互联系作用也对MG的表型转化产生影响。脑缺血损伤后，核因子-κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）的信号级联通路在调节促炎介质的释放作用中扮演重要角色。NF-κB可促使基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）表达和激活的水平升高，从而增强颗粒蛋白前体（progranulin，PGRN）的水解作用，诱导溶酶体在MG的贮存及促进炎症反应的发生[5,6]。其他转录因子也可能通过影响NF-κB的信号级联通路（包括Norch、STAT1、STAT3等），参与调节MG/巨噬细胞的表型转化[7]。Notch信号通路与NF-κB的级联作用可通过抑制过氧化物酶体增生激活型受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR γ）的表达，从而抑制M2表型诱导转化[8]。与NF-κB信号功能相反，cAMP反应元件结合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein，CREB）与转录因子CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT enhancer-binding protein β，C/EBP β）的相互作用[9]，可增强M2型特异性基因的表达，如IL-10和精氨酸酶1(arginase 1，Arg-1)，促进组织修复。

有研究表明，在梗死灶的周围区MG可表现出不同形态，而在缺血中心区主要以无树突状形态的MG为主。随着时间的推移，MG可表现出动态性的极化，主要从短暂的M2型向M1型转化。在缺血的急性期，以Ym2标记的M2型细胞可在缺血灶的周围区急剧上调，对缺血区起保护作用。在第7天的时候，只有小部分MG存在吞噬损伤组织碎片的功能。这表明在缺血最初，MG的活化更倾向于发挥保护神经元的作用，脑缺血损伤7 d后，M2表型标记（CD206、Arg-1、Ym1/2、Il-10和TGF-β）mRNA的表达下降，而M1基因标记（CD11b、CD16、CD32）在缺血后14 d仍居高不下[10]。这表明脑缺血后活化的MG具有双重角色的特点，深入研究不同活化表型的MG功能及调节不同细胞表型的平衡，对于脑缺血后以MG作为靶体细胞的治疗研究具有重要意义。

2 脑缺血后MG的靶向治疗

相关研究已对引起MG活化的不同信号通路，诱导的基因组反应及对周围细胞产生细胞毒性影响机制做了不同探索。许多针对这些进程的靶向药物原则上都是有效的，但由于其复杂的信号通路和效应机制使得针对某一个信号通路的靶向治疗不可能最有效。因此，靶向调节参与MG激活过程中的受体、信号通路及分泌物等的治疗都可能是另一个新的策略。从临床前研究中对具有上述作用的几类药物进行总结。

2.1 嘌呤受体抑制剂

嘌呤受体是脑损伤一个重要传感器，P2X7受体和P2Y12受体是最具有特色的嘌呤受体。近期，有关研究表示P2X4受体对MG的激活和存活同样具有重要的调控作用[11]。P2X7信号作用可通过激活多种促分裂原活化蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶家族成员，合成和释放TNF-α和IL-1β等多种细胞因子，促进MG增殖，产生活性氧簇造成脑损伤[12]。有关研究发现P2X7受体活化时MG的吞噬能力下降，表明阻断P2X7受体可能对MG吞噬活性及组织修复产生影响。有研究表明，MG和星型胶质细胞的活化可加重短暂性全脑缺血再灌注损伤后的糖氧剥夺，而Chu等[13]在大鼠短暂性全脑缺血再灌注模型中使用不同的P2X7受体拮抗剂发现其可明显提高缺血再灌注后大鼠的生存率，减轻记忆功能障碍及海马区炎症因子的产生。大部分研究表明，在脑缺血动物模型和脊髓损伤的实验中使用P2X7受体拮抗剂可减小缺血后的炎症损伤、梗死面积及神经功能缺陷等。然而Marcillo等[14]表示在大鼠局部缺血再灌注模型实验中应用P2X7受体拮抗剂维持6周观察中并未发现其能显著改善大鼠的行为功能恢复或组织病理学结果。这些研究结果的不同可能是由于P2X7受体及其他类型的嘌呤受体可在多种组织细胞上表达，拮抗剂的应用与体内多种受体的交叉反应所导致。

2.2 TLR受体抑制剂

Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）属于模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）家族，在天然免疫反应中能识别结合某些病原体及其产物所具有的相应的病原相关分子模式[15]。人类具有11种TLR，其中TLR2-4、TLR7-9与缺血性中风的炎症反应较密切。在中枢神经系统，TLR可广泛分布于各类神经细胞，高表达于MG和星型胶质细胞。脑缺血后坏死神经细胞等产生的病原相关分子模式，如高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）等可与MG上的TLR识别结合从而引起MG的活化。Sica等[16]研究发现TLR4在调节MG分化中具有重要作用，TLR4可通过激活NF-kB介导促炎因子（TNF-α、IL-12、SOCS3）和缺氧诱导因子α（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α）释放，促使诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）合成；同时也可诱导启动MG M1型极化和M2型基因沉默的主要转录调节者之一，干扰素调控因子3（interferon regulatory factor-3，IRF-3）的合成。近年发现TLR具有形成多聚体的特征，TLR2异二聚体（TLR2/1）和CD36联合信号可导致脑缺血炎症反应的发生和组织损伤[17]。因此，更深入地了解TLRs、配体及不同多聚体之间的相互作用，开发针对TLRs信号传导通路及其他联合信号的靶向药物，也是脑缺血后抗炎治疗的重点之一。

2.3 TNF-α受体拮抗剂

TNF-α是急性脑损伤中活化MG释放的一种重要免疫信号分子，是脑中风和创伤性脑损伤中极富前景的药物治疗靶点，目前已有相关的TNF-α拮抗剂应用于临床[18]。TNF-α可通过与神经元、MG等细胞膜上的跨膜TNF受体（TNFR），TNFR1（也称为P55/P60）一种包含死亡区域的蛋白受体，TNFR2（也称为P75/ P80）结合而发挥作用。在脑缺血后数小时内缺血区损伤区的TNF-α和TNF-α受体表达上调。有研究使用几种不同机制的TNF-α药理抑制剂表明，其在动物模型中可减少脑梗死面积，同时也提示针对损伤后MG介导炎症反应的靶向治疗其时间窗可适当延长[19]。近期多个研究也在脑缺血动物模型中使用TNF-α拮抗剂依那西普（etanercept）与血脑屏障-受体诱导剂融合应用，证实其对于脑缺血具有一定的保护作用，而其他的TNF-α拮抗剂萨力多胺（thalidomides）和萨力多胺衍生物（thalidomide derivatives）也证实具有很好的抗炎效应及神经保护作用[20]。大量的体外研究显示TNFR信号通路具有复杂性及分散性，这也使得TNF具有诱导细胞死亡及细胞活化等多个方面的作用。因此，开发具有选择性阻断TNFR信号通路的TNF-α拮抗剂也将是下一步的挑战。

2.4 PARP抑制剂

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（Poly(ADP-ribose)polymerases-1，PARP-1)是丰富的核内蛋白，参与DNA修复和转录调节。脑缺血再灌注产生大量的氧自由基可诱导氧化性单链DNA损伤，导致PARP-1的激活，催化ADP-核糖单位从NAD+靶向到组蛋白和转录因子形成PAR聚合物。PARP-1作为NF-κB和AP-1等转录因子的辅助因子，参与调控炎症基因表达。研究证实许多PARP抑制剂具有良好的中枢神经系统渗透性，其中部分已进入肿瘤和其他疾病的临床试验阶段[21]。相关的细胞研究证实，PARP-1抑制剂能阻断NF-κB的转录活动，抑制MG iNOS表达和MMP9等炎症介质释放，减少细胞的形态学改变和神经毒性作用[22]。Kauppinen等[23]在大鼠双侧颈动脉闭塞再灌注模型术后48 h给予PARP-1抑制剂（PJ34）治疗，发现其快速抑制脑缺血后MG的活化，组织学显示海马CA1区神经元密度增高，缺血后6～8周行为功能测试大鼠空间记忆和学习能力受损情况得到改善。另外，Stoica等[24]表示，在小鼠创伤性脑损伤模型中使用PARP-1抑制剂同样可有效减轻皮质MG的活化及神经细胞的缺失，改善运动功能恢复；这表明脑缺血损伤后抑制PARP-1的表达可减轻炎症反应的发生，对延长受损神经元存活时间及促进神经再生具有一定作用。

2.5 HDAC抑制剂

基因表观转录调控的机制之一是组蛋白的乙酰化修饰，即组蛋白乙酰转移酶（histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）所参与的乙酰辅酶A乙酰基在组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上的转移和去除。越来越多的研究表明HDAC在多种生物学过程中扮演着重要角色，包括炎症反应。HDACs抑制剂最初作为抗肿瘤新药受关注，目前已有部分作为抗肿瘤药物进入1期或2期临床实验[25]。有研究表明，HDAC抑制剂可通过抑制转录因子与促炎基因在启动位点上的结合从而减少iNOS与环氧化酶产生。研究发现，在多种脑缺血动物模型中给予HDACs抑制剂丙戊酸、丁酸钠治疗可有效减小脑梗死体积，减轻缺血后炎症反应和促进缺血区的神经再生。Kim等[26]研究HDAC抑制剂对炎症的影响，发现其可抑制MG的活化，减少的数量，抑制其他炎症因子的释放。近期，我国台湾研究者对34例急性大脑中动脉梗死患者采用丙戊酸治疗，首次证明丙戊酸治疗可明显改善急性大脑中动脉梗死患者神经功能结果，强调丙戊酸作为神经保护剂具有临床应用潜力[27]。

2.6 其他药物靶向治疗

2.6.1 二甲胺四环素 最早关于二甲胺四环素（Minocycline）神经保护作用的研究中表示其可以抑制脑缺血中MG的活化，同时在其他神经退行性疾病研究中也是一种极具潜力的抗炎药物。其抗炎作用可能与其对PARP-1的抑制作用相关。近期Yang等[28]研究发现，在急性脑缺血损伤中早期给予二甲胺四环素治疗可显著促进修复过程的血脑屏障重构及选择性激活MG/巨噬细胞表型。

2.6.2 皮质类固醇类 研究证实糖皮质激素可抑制缺氧诱导的MG激活，然而在相关实验中这种抗炎作用并不明显改善脑缺血甚至加重损伤，对于研究者来说需要更多的证据来评估皮质类固醇治疗在急性缺血性卒中的疗效[29]。

除此之外，许多药物、蛋白分子包括非甾体类抗炎药、丙泊酚及MG活化信号通路上的其他受体抑制剂包括CX3CR1拮抗剂[30]等也在临床前研究中证实具有抑制MG活化，减轻炎症反应的作用。

3 结论与展望

MG作为中枢神经系统炎症反应的启动者和介导者，其活化位点、功能反应和分泌因子效应都成为目前抗炎药物研究选择中的重要焦点之一。从脑缺血发作到MG充分激活状态需要相对较长的时间间隔（数小时），这也使得针对MG反应的靶向治疗具有临床可行性。然而目前仍有许多局限性：尽管许多药物也在临床前期试验中表现出良好的应用前景，但其在临床水平的急性损伤药物治疗方面仍缺乏进展；活化MG具有不同的作用，这也表明脑缺血后针对MG的治疗方向可能更应该是调节其损害与保护作用的平衡，确定药物实施治疗时间与持续时间，而不仅单纯抑制MG活化。深入研究脑缺血后MG的不同作用，通过对其活化调控过程中的信号通路及基因表达进行靶向干预，也将成为治疗脑缺血药物的重要发展之一。

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（本文编辑：王晶）

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.017

北京大学深圳医院神经内科广东 深圳 518000

深圳市科技计划项目（No.JCYJ20140415 162543033）

2015-06-04

易黎yilitj@hotmail.com