以肿瘤坏死因子α转基因小鼠为类风湿关节炎模型的研究进展＊

王腾腾，徐 浩，王拥军，3，施 杞，梁倩倩＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中医药大学康复医学院 上海 200120）

以肿瘤坏死因子α转基因小鼠为类风湿关节炎模型的研究进展＊

王腾腾1，2，徐 浩1，2，王拥军1，2，3，施 杞1，2，梁倩倩1，2＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032；3.上海中医药大学康复医学院 上海 200120）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种慢性自身免疫疾病，肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）过表达在本病的发病过程中起到重要的作用，并介导了多种炎症因子的表达。目前抗TNF药物已广泛应用于RA临床。过表达人TNF-α的转基因小鼠可出现类似RA的病理表现：起病缓慢、发病率高、模型稳定。因此，TNF转基因（TNF-Tg）小鼠模型在RA研究中具有重要的意义，现已广泛应用于RA的诊疗技术和病理机制研究，尤其是淋巴管功能的研究，并取得一系列成果。本文针对该模型小鼠的生理病理特征、研究进展进行综述。

肿瘤坏死因子α 转基因小鼠 类风湿关节炎 淋巴

RA是一种以对称性、多发性关节炎为主要临床表现的慢性免疫性疾病，主要的病理改变为：滑膜的增生、炎性因子的浸润、软骨及骨组织的破坏等[1]。为研究其病理机制及治疗方法，多种动物模型已应用于基础医学研究中。常见模型有诱导型、手术型及转基因型。诱导型又包括佐剂诱导、蛋白酶诱导及血清诱导等[2]。转基因模型包括：过表达TNF及其受体、过表达胶原酶、K/BxN转基因模型等。上述模型已运用于风寒湿型、风湿热型、脾虚型[3]等中医病证结合模型研究中。

随着抗TNF-α药物的出现，TNF-Tg小鼠模型已成为常用的研究RA的模型，本文对该动物模型的文献进行综述如下。

1 TNF-α在RA中的作用

TNF-α在肿瘤恶病质、内毒素休克、器官移植后免疫排斥、自发性免疫病及RA等多种疾病的进展中起着重要的作用。在RA患者的炎性滑膜、软骨及血管翳中，TNF-α水平异常升高，TNF-α本身既可引起关节炎症，还可引起成纤维细胞样的滑膜细胞的增生，导致滑膜炎症；可通过促进胶原酶的产生、抑制关节软骨细胞蛋白多糖的合成从而引起软骨的破坏；或可通过泛素连接酶抑制间充质干细胞向成骨细胞分化[4]、刺激破骨细胞生成、抑制破骨细胞凋亡[5]，或促进前体破骨细胞随血液循环进入NF-κB受体激活蛋白配体（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL）高表达水平的滑膜关节从而引起骨的侵蚀[6,7]。大量研究已经证明，在RA中TNF-α位居多种促炎症因子的上游，抑制TNF-α可以抑制白介素1（Interleukin1，IL-1）、IL-6、IL-8及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF）等其他促炎症因子。抑制TNF-α几乎可以缓解所有的RA模型动物的关节炎症状，更进一步证明了TNF-α在RA中的重要作用。Manara等[8]和Catrina等[9]的多中心临床对照试验表明抗TNF-α疗法可缓解RA患者的关节炎症、提高其患肢功能及活动度，减轻软骨及骨组织的破坏，抗TNF-α疗法可促进RA患者滑膜巨噬细胞的凋亡，提高患者关节功能。基于抗TNF-α的药物已应用于临床，常见药物有依那西普（TNFR2抑制剂）、塞来昔布等。

2 TNF-α的合成及调控

TNF-α因其可促进肿瘤坏死而命名，在急性炎症反应中，主要由活化的巨噬细胞分泌，T细胞、NK细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、上皮细胞、角质细胞及成纤维细胞均有产生。TNF-α存在跨膜型和分泌型两种活性形式，作用各不相同[10]。一般认为，跨膜蛋白可在TNF-α转化酶（Tumor Necrosis Factor-α Converting Enzyme，TACE）的作用下，转化为分泌蛋白，从而发挥作用。但是，将编码分泌蛋白1-12号氨基酸的序列敲除，使TNF-α不能分泌，转基因小鼠依然可表现出关节炎症，且抗TNF-α单抗治疗有效，TNF转化酶抑制剂治疗无效，证明TNF-α的跨膜蛋白也具有生物活性，在关节炎症与骨侵蚀方面也起着重要的作用。

TNF-α主要受其本身mRNA的3’-UTR端的AU富集区（AU-Rich Element，ARE）的调控。在细胞静息状态下，TNF-α的降解主要由ARE介导，锌指蛋白36（Tristetraprolin，TTP）也参与了抑制TNF-α的过程。在调控过程正常运行的情况下，TNF-α可介导急性炎症。若该调控过程发生紊乱，如：TNF-α过表达及TTP敲除的转基因小鼠，可发生慢性炎症，从而继发一系列全身的病理改变。

3 TNF-Tg小鼠模型的生理病理学特点

常见的TNF-Tg小鼠模型1981年于George Kollias实验室培育成功[11]，利用基因打靶载体，将人TNF基因ARE的3’-UTR端由β球蛋白的3’-UTR端代替，保证了TNF-α的转录效率，可使该系小鼠关节、肺、脾等组织慢性、持续性过表达人TNF-α。

TNF相关的转基因小鼠亦存在多种形式。将ARE的3’-UTR端敲除可得到TNFΔARE小鼠[12]，可出现类似克罗恩病的肠炎，关节炎出现率为100%，全身关节均受累，该品系小鼠也是第一个颞颌关节炎模型。但如果把白足小鼠Tnf基因的整个3’-UTR端敲除，可发展成为强直性脊柱炎而无周围关节炎的表现。因人TNF-α只能与TNFR1结合而不能与TNFR2结合，提示在某种程度上，TNFR2可能与RA发病无关；但是TNFR2敲除会加重TNFΔARE小鼠的关节炎症，其在关节炎症中的作用有待进一步研究。

常见的无发育缺陷的TNF-Tg有2个亚型：3647和197。3647品系携带人的1个TNF拷贝基因，2月龄开始出现踝关节肿胀。197品系携带5个拷贝基因，4-5周龄出现表型，且症状较3647更为严重；9-10周龄后肢丧失活动能力，体质量逐渐减轻，纯合子的197品系12-14周即死亡。因此，3647品系存活时间长，炎症进展缓慢，实用性较高，本文重点讨论该品系。

3647品系小鼠以C57BL/6VBA为杂交背景，杂合子的雄性与野生型雌性杂交而生，出生杂合子阳性小鼠的概率约为50%。小鼠表现为对称性、多发性关节炎。整个病程都可见滑膜的增生及炎症细胞的浸润。病程的晚期可出现软骨及骨组织的侵蚀，骨的表面出现大量多核抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP）染色阳性的破骨细胞。以上病理表现与RA患者的临床表现极为相似，但是整个病程中小鼠血清的类风湿因子是阴性的。抗TNF可完全阻断炎症的产生，纯合子的饲养需要持续的抗TNF治疗。

TNF-Tg小鼠的最大优势在于其病程进展呈现慢性炎症、病情稳定。与之相比，胶原诱导模型更为严重，佐剂诱导模型有一定自限性[13]。而且，该模型小鼠是非免疫依赖型的，与重组活化基因（RAG）敲除小鼠（无T细胞、B细胞）杂交后，仍可表现侵蚀性关节炎，证明该病程非免疫依赖性，有利于研究RA除自身免疫性疾病以外的分子机制。该模型小鼠与易发关节炎的DBA/1杂交后，关节炎发病更早，程度更重，说明致敏基因DBA/1与TNF-α联合作用可加重RA。

4 TNF-Tg小鼠在RA研究中的应用

尽管TNF-α的RA的发病中十分重要，在TNF-α缺失的情况下，破骨细胞生成、侵蚀性关节炎及骨溶解仍可发生。敲除TNF-α或TNFR1后，小鼠仍可出现胶原诱导型关节炎（Collagen-Induced Arthritis，CIA），但发生率降低。因此，TNF-α极有可能在RA的某个阶段发挥作用。临床上30%的患者应用抗TNF-α疗法无效，亦证明了这一猜测。TNF-Tg小鼠为研究RA的病理分期提供了良好的模型。

TNF-Tg小鼠为研究TNF-α与其他炎性因子的上下游关系提供了依据。IL-1可以促进基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）的产生，促进软骨的降解及骨吸收。用IL-1受体阻断剂治疗该品系小鼠，可抑制关节炎症的进展，提示IL-1可能是TNF-α的下游因子。而且，循环系统中的人TNF-α减少，证明阻断IL-1会对TNF-α产生负反馈调节[14]。IL-6升高在RA中会导致炎性细胞的浸润、滑膜增生以及破骨细胞的活化。TNF-Tg小鼠血清IL-6水平升高，但与IL-6基因沉默的小鼠杂交，对病程进展无明显影响，避免了病理分子机制研究的混杂性[15]。与之相比，CIA模型对IL-6呈依赖性，敲除IL-6或IL-1后，CIA模型关节炎症可减轻或完全抑制。在关节炎中，对组织起直接破坏作用的是MMP，其中MMP-1、3、9、13在RA患者的滑膜、滑液及血清中高表达，抗TNF-α治疗可下调其水平，证明TNF-α会促进MMPs表达[16]。TNF-Tg小鼠关节中MMP-3、 9、13是高表达的，TMP治疗可缓解骨破坏。

RANKL/RANK信号通路骨吸收过程中起着重要作用，骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）治疗有效，提示针对该通路治疗骨侵蚀意义重大。肌生成抑制蛋白（Myostatin）在该模型小鼠中高表达，敲除Myostatin或使用单克隆抗体治疗后，小鼠的骨破坏得到缓解，提示TNF-α可能通过高表达Myostatin激活RANKL/RANK信号通路实现骨破坏[17]。

TNF-Tg小鼠滑膜有明显的血管新生，这与RA患者的临床表现一致。抗血管新生药物内皮抑素治疗转基因小鼠有效[18]，提示了血管增生在TNF-α介导的关节炎中的重要作用。

淋巴管的生成及功能在RA中的作用越来越受到重视。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）可通过促进淋巴回流功能减轻关节炎症[19]。研究表明，TNF-Tg模型小鼠关节中的前体破骨细胞通过NF-κB通路VEGF的表达量增高，促进淋巴管生成；CIA模型小鼠也观察到相同的改变[20]。该模型炎症发病前，腘窝淋巴结肿大，腘窝淋巴结、髂淋巴结的萎缩可作为关节炎发病的标志，并进一步探讨了其机制可能与B细胞的迁移有关[21,22]。独活寄生汤[23]、阿魏酸[24]可通过促进淋巴管回流功能起到治疗该小鼠模型关节炎的作用。淋巴管功能的改变已得到临床试验的验证，有可能成为评价RA发病的新指标[25]。

在诊疗技术方面，Micro-CT及增强对比磁共振技术对关节滑膜体积、淋巴结体积[18]、多普勒超声可有效检测该模型小鼠的关节体积及多普勒信号[26,27]，拓展了RA的早期诊断技术范围。

该模型小鼠用来证明TNF-α在压迫性骨髓水肿的发病过程中起到重要作用，可通过生物力学的改变缓解；单纯抗TNF-α治疗无效[28]。5月龄的TNF-Tg小鼠因为骨破坏严重，作为继发性骨质疏松的模型，也被用来进行拉曼光谱学[29]的测量，实验证明，该模型小鼠股骨断裂载荷及断裂韧性降低，可能通过泛素连接酶Smurf1介导了骨丢失[30]。

5 总结与展望

TNF-Tg小鼠模型表型稳定，存活周期相对较长，不需借助药物诱导，是一种有效的工具，在类风湿性关节炎的病理机制、分期分型等研究中具有重要的意义，有利于药物的开发及诊疗技术的改进[31]，值得推广研究。但是，作为一种转基因小鼠模型，它也有自身的局限性，存在不能完全复制疾病的病理状态、存在其他生理缺陷、动物繁殖数量有限等多种问题，但这并不能掩盖它的应用价值。鉴于TNF-α在多种疾病中的重要作用，该模型小鼠也将应用到与TNF-α有关的病理机制的研究中，有利于探讨多种疾病的相同分子机制，可拓展药物的治疗范围及中医学“异病同治”理论的研究。TNF-Tg小鼠淋巴管回流功能、淋巴管内压下降，亦可成为研究淋巴管结构与功能的工具。

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A Research Progress on the Rheumatoid Arthritis Model Using TNF Transgenic Mouse

Wang Tengteng1,2, Xu Hao1,2, Wang Yongjun1,2, Shi Qi1,2, Liang Qianqian1,2
(1. Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 2. Institute of Spine Disease, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China; 3. School of Rehabilitation Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China)

Rheumatoid arthritis (RA) was recognized as a chronic and autoimmune disease. The overexpression of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) was of great significance in the pathogenesis of RA and mediated the levels of various inflammatory factors. At present, anti-TNF agents were widely used for the treatment of RA in clinic. The genetically modified mice, overexpressing human TNF-α, could appear pathological manifestations being similar to RA with slow onset, high incidence rate and stable occurrence. Therefore, TNF transgenic (TNFTg) mouse model was significant in the study, generally applied to the curative and mechanism researches of RA, especially some remarkable and fruitful studies over lymphatic vessels. In this study, we summarized the pathophysiological characteristics of the mouse model based on the current research status.

Tumor necrosis factor alpha, transgenic mice, rheumatoid arthritis, lymph

10.11842/wst.2016.11.006

R274

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-11-04

修回日期：2016-11-20

＊ 国家自然科学基金委重点项目（81330085）：痰瘀型类风湿性关节炎与淋巴关系的基础研究，负责人：施杞；国家自然科学基金委重大国际合作项目（81220108027）：益气祛湿法调控淋巴系统对炎症性关节炎的影响，负责人：王拥军；教育部高等学校全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目（201276）：负责人：梁倩倩；上海市龙华医院龙医创新团队（LYCX-01）：祛瘀化瘀防治颈痛和炎性关节炎的基础研究，负责人：梁倩倩；上海市卫计委中医药三年行动计划项目（ZY3-CCCX-2-1002）：国家中医临床研究基地建设项目，负责人：崔学军；筋骨理论与治法教育部重点实验室，负责人：王拥军；上海市长宁区卫生与计划生育委员会“光华卓越PI工程”项目（2016-01），负责人：施杞。

＊＊ 通讯作者：梁倩倩，副研究员，硕士生导师，主要研究方向：中医药治疗关节炎症性疾病的疗效及机制研究。