分枝杆菌菌种鉴定方法及其进展

辛茶香，张周云综述，熊国亮审校(江西省胸科医院检验科，江西南昌330006)



分枝杆菌菌种鉴定方法及其进展

辛茶香，张周云综述，熊国亮审校
(江西省胸科医院检验科，江西南昌330006)

摘要：分枝杆菌及其所致疾病的基础研究、预防和治疗中，菌种鉴定具有十分重要的意义。随着分子生物学诊断技术的不断进步，分枝杆菌菌种鉴定方法得到了很快的发展。本文从细菌学、生化反应、免疫学、分子生物学等技术对分枝杆菌菌种鉴定及进展做一综述。

关键词：分枝杆菌；菌种鉴定；进展

分枝杆菌（Mycobacterium）是人类历史上最重要的病原微生物群之一。分枝杆菌属的250多种菌种中，分别包括结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌（临床上已少见）。我国现有结核病患者700万，据2010年第五次全国结核病流行病学调查，其中非结核分枝杆菌（NTM）的感染率为22.9%[1]，对人类致病的NTM有20余种。近年来，NTM病呈快速增多趋势，并已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[2]。分枝杆菌感染引起的肺结核病和非结核分枝杆菌（NTM）肺病二者在临床特点极其相似，临床上极易将NTM肺病误诊为肺结核病，不同菌种感染引起的疾病其治疗方案是截然不同的，尤其是由不同的NTM引起的NTM病，在化疗方案的选择和用药时间都各不相同。有研究认为62%抗结核治疗效果不佳的肺结核为NTM感染[3]，也就是说临床上误将NTM肺病当肺结核病治疗导致治疗效果不佳的现象比较常见。因此，2012年我国专家在诊断和治疗分枝杆菌病达成了一个共识，要求在诊断和治疗前进行分枝杆菌菌种鉴定[4]，明确是结核分枝复合群感染还是非结核分枝杆菌感染、以及是何种非结核分枝杆菌感染，以便能对不同分枝杆菌感染进行对症治疗。所以，在分枝杆菌及其所致疾病的基础研究、预防和治疗中，菌种鉴定具有十分重要的意义。分枝杆菌菌种鉴定的方法较多，如细菌学法、免疫学法等，近年来，随着分子生物学诊断技术的不断进步，分枝杆菌菌种鉴定方法得到了很快的发展。现对分枝杆菌菌种鉴定方法及其进展做一综述。

1　生化反应方法鉴定菌种

该方法为传统的实验室方法，包括液体和固体培养基培养，最常用的液体培养技术为Bactec960方法，该培养技术仅能鉴定结核分枝杆菌复合群（MTB）和NTM。固体培养基以罗氏培养基为主，如培养出分枝杆菌菌株后，在进行抗结核药物的药敏试验时，将菌种接种于含对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸酰肼鉴别培养基上，并辅以硝酸还原试验、烟酸试验和耐68℃热触酶试验，初步鉴定为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或NTM。然后，再观察细菌的最适宜生长温度、生长速度和光反应等，通过观察一系列生化反应来进行菌种鉴定[5-7]。传统的实验室鉴定方法简单，并易于推广而一直沿用至今，但是耗时较长，操作繁琐，污染大，缺乏可重复性，不能及时、准确为临床提供参考[8]，临床难以常规开展。

2　免疫学方法鉴定菌种

免疫法只能将分枝杆菌区分为MTB还是NTM。待测样本预处理后接种到液体培养基或固体培养基上，在37℃的条件下，对样本中的分枝杆菌进行分离增菌培养。分枝杆菌在生长过程中，会分泌多达240多种的分泌蛋白。而其中的MTB64是分枝杆菌分泌蛋白中分泌时间早，分泌量最多的分泌蛋白，也是结核分枝杆菌群的特异分泌蛋白，而非结核分枝杆菌则不具有该蛋白。因此，检测和鉴定该特异分泌蛋白的有无可以被应用于鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌[9]。沈瑶杰[10]等应用免疫胶体法鉴定了临床样本中培养出的51株分枝杆菌，以16SrRNA测序结果为金标准，16株胶体法鉴定为非结核分枝杆菌经测序确定的有9株，35株胶体法鉴定为结核分枝杆菌以测序确定的有34株，其敏感性为56.3%，特异性为97.1%。

3　高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是运用高效液相色谱仪直接检测分枝杆菌细胞壁枝菌酸和对细菌染色体的GC%进行菌种鉴定，HPLC能有效地鉴定50多种分枝杆菌。该方法具有准确、可靠、结果稳定等优点，适于细菌分类研究，但限于对标本纯度的要求及操作的复杂性，以及HPLC设备价格昂贵，临床推广有一定困难[11]。

4　核酸探针法

由美国Hologic Gen-Probe开发的Accuprobe系统，主要用于对分枝杆菌分离培养物（固体或液体培养物）中结核分枝杆菌复合群和胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等非结核分枝杆菌培养物的鉴定。该方法的原理为以吖啶酯标记的菌种特异性DNA探针与分枝杆菌的16SrRNA进行杂交，在培养阳性的标本中2h即可获得结果，同时操作简单，结果准确性高等优点。目前，商品化的AccuProbe cDNA探针及配套的化学发光检测仪已在临床应用，但是，该商业化探针仅用于少数NTM菌种的鉴定[12]。

5　PCR或多重PCR法

用各种分枝杆菌特异性引物对标本中的菌株DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩增产生的特异性片段进行鉴定；或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌种特异的内部引物进行套式扩增鉴定。该方法具有灵敏度高和快速等优点，但目前仅能鉴定MAC、副结核分枝杆菌、MTB和麻风分枝杆菌等27种分枝杆菌[13]。

6　PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术

PCR-RFLP是将PCR技术、RFLP电泳方法联合，通过PCR扩增一段DNA片段，然后再选择适当的限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA片段，可得到有特异性的电泳谱带，从而达到鉴定不同基因型的目的。Kim等[14]以hsp65基因和rpoB基因为靶基因，分别扩增MTB 和NTM的235、136bp的基因片段，对44株分枝杆菌参考株和379株临床分离株进行检测，并进一步对18株NTM选用限制性内切酶MspⅠ、HaeⅢ进行酶鉴定，以此建立了PCR-RFLP法。万彦林[15]等以rpoB基因为靶基因设计分枝杆菌属特异性通用引物，用限制性内切酶MspⅠ对PCR扩增产物进行酶切，对酶切结果进行分析，对98株分枝杆菌的鉴定结果与传统鉴定法完全一致，其灵敏度、特异度和准确度均为100%，方法学评价指标结果达到诊断性实验的要求，为早期诊断结核病与NTM病提供了新的手段。在PCR-RFLP基础上研制的线性探针反向杂交法（INNO-LiPA）分枝杆菌菌种鉴定方法可鉴定出堪萨斯分枝杆菌、脓肿分枝杆菌和龟分枝杆菌等16种分枝杆菌[16]。

7　PCR-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术

PCR-SSCP技术是1989年日本Orita[17]创建的一种在PCR技术基础上发展起来的筛查PCR扩增产物点突变的新技术，它的原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA，单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象，其构象直接影响泳运速率，相同长度的DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别，就可以产生立体构象的不同，造成泳动速率的不同，产生不同的电泳带，从而分离出构象有差异的分子。根据SSCP电泳图谱与分枝杆菌标准株的电泳结果，进行相似性比较。靳晓红等[18]用PCR-SSCP方法通过设计2对引物分别扩增16S rDNA 2条片段，根据SSCP电泳图谱与分枝杆菌标准株的相似性鉴定结核分枝杆菌、NTM，对98株临床分离株进行了分析。结果表明，该方法对MTC及NTB的鉴别比细菌学方法快速，仅用3d，且与细菌学方法具有良好的一致性。该方法可及时鉴别MTB与NTM，对于临床复治、难治结核病的诊断及药物选择有重要作用。不足之处在于电泳条件要求比较严格，当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，可能会使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨，造成漏检[8]。

8　DNA测序技术

DNA测序技术主要原理是通过比较同源基因/序列的差异来进行菌种鉴定，是目前分枝杆菌菌种鉴定技术中分辨率最高、结果最为可靠的技术。目前最常用的分枝杆菌菌种鉴定的序列为16SrRNA编码基因，可作为其他鉴定技术的参考标准。Ngan等[19]以16S-23SrRNA内转录间隔区（ITS）为靶基因，建立多重PCR法结合产物直接测序技术检测了临床分离的247株分枝杆菌，结果显示敏感性和特异性均为100%。王峰等[20]以16S-23SrDNA转录间隔序列（ITS）PCR-直接测序法检测了21株分枝杆菌标准菌株和50株临床分离株，结果21株分枝杆菌标准菌株中有18株鉴定到种，结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌菌株只能鉴定到结核分枝杆菌复合群，但海分枝杆菌无法鉴定到是海分枝杆菌还是溃疡分枝杆菌；50株临床分离株，鉴定结果为胞内分枝杆菌10株，脓肿分枝杆菌19株，鸟分枝杆菌5株，鸟分枝杆菌复合群（MAC）3株，MTB6株，堪萨斯分枝杆菌3株，偶然分枝杆菌2株，苏尔加分枝杆菌1株，慢黄分枝杆菌1株。该方法可以实现对分枝杆菌快速准确的鉴定。

9　基因芯片技术

基因芯片技术是借助PCR技术，同时将大量的探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性，对DNA样品的序列信息进行高效的解读和分析。目前的研究已阐明许多分枝杆菌的16SrRNA和rpoB基因的核苷酸序列是高度保守的，具有种属特异性，因此可以鉴定分枝杆菌菌种。张立群等[21]利用分枝杆菌16SrRNA基因编码序列为靶基因，用基因芯片技术有效的鉴别出17种分枝杆菌，且灵敏度为81.6%、特异度为100%。李洪敏等[22]利用rpoB基因芯片技术快速进行分枝杆菌菌种鉴定。以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因，用芯片技术检测126株临床分离株经rpoB基因芯片鉴定为98株结核分枝杆菌，9株为NTM。分枝杆菌基因芯片鉴定技术提高了菌种鉴定的敏感性、准确性，适用于临床多标本检测的需要，省时，成本相对降低，有较为广泛的临床应用价值。

10　PCR-反向点杂交技术

PCR-反向点杂交技术是近几年来建立的一种快速鉴定分枝杆菌菌种的新方法，该技术的原理是以分枝杆菌rpoB基因编码序列为靶基因，设计特异的PCR引物且其5’端用生物素进行标记，扩增获得一定长度的分枝杆菌基因片段，该片段包含了所要检测的所有分枝杆菌菌种类型。根据不同分枝杆菌之间的差异，按照碱基互补配对原则，设计特异性识别某种分枝杆菌序列的寡核酸探针。探针5’端用氨基标记，通过化学键作用固定在硝酸纤维膜上，制成包含探针陈列的膜条。将带有生物素标记的PCR扩增产物与膜条上的探针进行分子杂交，再通过显色，观察膜条特定位置显色，从而鉴定该分枝杆菌的种类。该技术最大特点就是，可以对标本培养物或直接对患者痰标本或支气管肺泡灌洗液中的分枝杆菌进行菌种鉴定，大大缩短了鉴定检测时间，同时鉴定的菌种涵盖了对人致病的结核分枝杆菌群和22种非结核分枝杆菌，是一种简便、准确、快速鉴定分枝杆菌菌种的方法。该技术有望成为临床实验室鉴定分枝杆菌菌种的常规方法。展望

分子生物学技术在分枝杆菌菌种鉴定方面展现了其独特的优势及巨大的应用前景，为分枝杆菌菌种鉴定提供了一种快速、准确、有效的方法。同时将分子生物学技术和细菌学、免疫学方法相结合，发挥各自的优势，是分枝杆菌菌种鉴定的一个方向[23，24]。相信随着分子诊断技术的不断完善和新技术的不断涌现，将为临床快速、准确鉴定分枝杆菌菌种作出更大贡献。

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·论著·

(收稿日期2015-11-30；修回日期2015-12-18)

作者简介：辛茶香，女，1969年8月生，本科，副主任技师，主要从事结核病的细菌学、免疫学、分子生物学检验工作。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.001

中图分类号：R446.5，R378.91

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)01-0001-03