骨髓活检与骨髓细胞学相结合在现代血液病诊断中的意义

2016-04-04蔺金军赵鸿薇魏军龙陈辉树

实用检验医师杂志 2016年2期

关键词：意义

蔺金军　赵鸿薇　魏军龙　陈辉树

蔺金军赵鸿薇魏军龙陈辉树

【摘要】随着骨髓活检与骨髓细胞学在血液病诊断中不断应用，尤其两者同步进行，相互结合、相互补充在综合诊断血液系统疾病方面发挥了重要作用，临床诊断准确率明显提高，成为现代血液病诊断的基础。

【关键词】骨髓活检；骨髓细胞学；相结合；血液病诊断；意义

骨髓活检（bone marrow biopsy，BMB）在我国血液病诊断中的应用已60余年了［1，2］，从传统的石蜡包埋切片到二十世纪80年代的塑料包埋切片，从选择性骨髓活检到每一例患者同步进行骨髓细胞学（bone marrow cytology，BMA）检查和BMB，发挥了二者各自的优点，对血液肿瘤、包括淋巴瘤侵犯骨髓、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓转移性肿瘤和再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）等都起到了极其重要的作用。

1　BMA与BMB组织形态学检查相结合是现代血液病诊断的基础

现代血液病诊疗医学进入了 “精准诊断与精准治疗”时代，血液病诊断采用国际通用的形态学（M）、免疫学（I）、细胞遗传学（C）和分子生物学（M）相结合即“MICM”诊断模式［3，4］。首先，形态学（骨髓细胞形态学和骨髓组织形态学）是基础，因占很大比例的良性血液病常常没有遗传学及表型异常，良性血液病主要根据外周血和骨髓形态学确定为某种疾病即可得以相应治疗。即便是全血细胞减少的疾病，其中很大部分是AA，脾功能亢进（如门脉高压性）或营养性贫血，这些疾病并没有重现性染色体异常。即便是恶性血液病的遗传学异常也不是100%存在的，例如早幼粒细胞白血病［PML－RARa融合基因有t（15；17）（q22；q12）易位占急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）7%、AML（M2b）－ETO融合基因有t（8；21）（q22；q22）易位的占AML14%，AML（M4Eo）CBFβ－MYH11融合基因有inv（16）（p13；q22）或t（16；16）（p13；q22）易位各占全部AML的5%～8%］。另一方面慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）BCR／ABL有t（9；22）（q34；q11）易位，为典型的CML 90%～95%的遗传学特征，但其亦见于成人急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）（15%～30%）及儿童ALL（2%～5%），此时BMA和BMB结合免疫组化诊断CML和ALL简便易行。另三种骨髓增殖性肿瘤JAK2V617基因检出率分别为真性红细胞增多症95%，原发性血小板增多症50%，原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF）50%，但这三种血液肿瘤如无 JAK2V617及外显子 exon12，LNK，MPLW515L，CALR，ASXL1，TET2，SRSF2及IDHI／2时，需要结合临床表现、血象、BMA形态及 BMB组织形态诊断［5］，更进一步说明BMA和BMB在血液病诊断中的重要性。

AA传统的诊断标准为外周血粒、红和血小板三系（全血细胞）减少，其中网织红细胞＜1%，中性粒细胞＜0.5×109／L，血小板＜20×109／L，成熟小淋巴细胞相对增多＞50%。BMA和BMB均显示有核细胞增生极度减低，不见巨核细胞，脂肪细胞及非造血细胞增多。但采用BMB＋免疫组化CD34（干细胞）、CD117（祖细胞）及CD61（巨核细胞／血小板）抗体染色排除低增生性MDS之后，再诊断为AA并行相应治疗，可避免“AA”经“ATG／环抱菌素，甚至GM CSF”治疗一段时间后发生急性白血病的可能性。因为此种AA可能是由于潜在的突变基因未被发现而当作AA进行免疫抑制治疗，破坏了机体免疫防卫系统，激活了突变的癌基因而发病。

再有，巨幼细胞性贫血（megaloblastic anemia，MA）可表现为全血细胞减少，在MA诊断中骨髓涂片优于BMB［6］。根据外周血示贫血或全血减少，MCV＞100 fl，叶酸和维生素B12降低。骨髓涂片呈巨幼细胞改变即可诊断，BMB不能单独明确诊断，但BMB免疫组化排除MDS后，并结合补充叶酸和维生素B12后血象恢复正常即可证实为本病。

2　BMA结合BMB及免疫组化在血液肿瘤诊断中的意义

血液肿瘤包括髓系肿瘤和淋系肿瘤两大类，WHO髓系与淋系肿瘤病理与遗传学分类标准2016年版［7］除增加较多新的分子遗传学标志外，形态学分类变化不大。

2.1AML按照2008年版WHO髓系肿瘤病理与遗传学分类标准［8］，必须结合免疫表型，染色体核型／融合基因原位杂交／RT－PCR检测结果，才能对AML进行血液病理及遗传学分类诊断。对AML、MDS、MPN和MD／MPN用BMA瑞氏染色进行传统的FAB形态学分型。虽然有免疫组化和流式分析，但某些细胞化学检测AML－M4、M5、M6、M0，微分化白血病等仍有辅助诊断意义。因BMB结合免疫组化能明确AML的诊断，但不易区分AML的FAB各亚型［9］。对白血病化疗后临床疗效监测，BMB优于骨髓涂片，但最准确还是流式细胞分析结果。

2.2CML（CML－BCR／ABL＋）①根据外周血白细胞≥100× 109／L和分类中性粒细胞（中晚幼粒细胞比例）显著增多，嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞增多，单核细胞计数＜10%。血小板计数正常或显著增多（但不减低），BMA示各阶段粒系细胞显著增多，分化正常，原始细胞＜5%。BMB示粒系细胞增生极度活跃，无脂肪细胞，红系细胞很少，以单圆核巨核细胞为主是其特征。免疫组化显示CD34和／CD117散在少数（＋），CD61主要为单圆核巨核细胞（＋）、90%～95%ph染色体（＋）及BCR／ABL融合基因（＋），即可诊断本病［10］。②如果免疫组化显示CD34和／CD117散在（＋）或散在多（＋）即为CML加速期或急性髓细胞变。如果CD34＋、TdT＋、CD20＋／CD3＋即为T／BALL变。③如血红蛋白和血小板减少，外周血WBC≥25×109／L，晚幼阶段以上幼稚粒细胞≥10%，原粒细胞＜20%，BMA有病态造血，BCR／ABL（－）即为不典型CML［aCML－BCR／ABL（－）］。

2.3ALL淋巴母细胞淋巴瘤／ALL分为T细胞和B细胞两大类，即T和B－LBL／ALL，各年龄均可发病，BMA示淋巴母细胞≥25%即为ALL，75%ALL发生在6岁以下儿童，T－ALL占儿童ALL的15%。BMA原始淋巴细胞胞体小至中等大，胞质少或中等呈浅灰蓝色。核染色质弥散，核仁多个。细胞化学染色胞质磷酸酶和糖原染色（＋），如胞质有空泡者（FAB分类为ALL－L3），现为Burkitt淋巴瘤／白血病，不属于ALL（因TdT－）；BMB示ALL中等大小的淋巴母细胞弥漫性均一性增生，粒、红及巨核系细胞相对减少或缺乏。BMB免疫组化示TdT＋，CD34＋，如同时CD20或／和CD79等B标记阳性为BALL，同时CD10＋为普通型B－ALL；如同时CD3或／CD2等T标记阳性为T－ALL。后者没有重现性染色体异常，B－ALL除一种非特指性的B－ALL外，还有7种伴遗传学异常的BALL［依次为B－ALL伴t（9；22）（q34；q11.2）；BCR－ABL，BALL伴 t（v；11q23）；MLL重排，B－ALL伴t（12；21）（p13；q22）；TEL－AML1（ETV6－RUNX1），B－ALL伴超二倍体，BALL伴亚二倍体，B－ALL伴t（5；14）（q31；q32）；IL3－IGH，BALL伴t（1；19）（q23；p13.3）；E2A－PBX1（TCF3－PBX1）］。一般结合免疫组化，流式细胞分析和分子遗传学检测即可明确诊断与分型。急性系列未明白血病的免疫表型必须由流式细胞术检测确定。

2.4MDSBMA瑞氏染色分类不但可以确定原始细胞数量（1%～19%），还可确定髓系一系、两系或多系细胞发育异常（国内称病态造血）。粒、红系病态造血细胞分别占各系的10%。随机计数100个巨核细胞，其中圆核巨核细胞（单圆、双圆、多圆核及淋巴样巨核细胞）必须≥30%才反映巨核细胞病态造血。文献报告病态改变细胞也可见于血细胞不减少的那一系。根据外周血原始细胞比例和BMA原始细胞比例将MDS分为RA，RAEBⅠ和RAEBⅡ；而流式细胞术可显示原始／幼稚细胞数量及表型，还可显示髓系细胞分化异常和／或表型紊乱，类似于表型意义上的“发育不良”（有病态造血的含义）。BMB组织切片不能分型或分级，但免疫组化可显示一定数量CD34（＋）和 CD117（＋）圆核细胞，CD61（＋）圆核巨核细胞，BMB网状纤维染色在MDS诊断中有辅助意义。结合上述各项检查及相关染色体或基因检查（MDS染色体异常包括基因突变占60%～90%）即可明确诊断本病。30%左右的中老年患者全血细胞减少，长期对促造血药物治疗无效，BMA、BMB和流式分析均有MDS特点，即使暂时尚未发现染色体异常亦可诊断。

2.5真性红细胞增多症好发于中老年患者，中位年龄60岁（20岁以下罕见），主要症状与血容量增多引起的高血压和血管异常有关，常面红似醉酒状，多伴有头痛，眩晕及视觉障碍。70%脾肿大，40%肝肿大。2016年修订版WHO造血与淋巴组织病理与遗传学分类中关于真性红细胞增多症患者Hb＞165 g／L（男）或160＞g／L（女）［11］。BMA有核细胞增生程度极度活跃，巨核细胞以分叶核胞质丰富的中等大巨核细胞为主，易见单圆核巨核细胞。BMB示粒、红、巨核三系（全髓）增殖，与BMA一致缺乏特征性组织形态改变。免疫组化也缺乏特征性表型。本病主要是95%有JAK2V617F基因突变（见前述）导致红系细胞过度增生，红细胞生成素降低，诊断时首先根据上述基因检查排除反应性红细胞增多后才能确诊。

2.6原发性血小板增多症各年龄均可发病，多见于50～60岁，半数以上无症状，50%脾轻度肿大，15%～20%肝肿大。外周血小板计数≥450×109／L，BMA示成堆的血小板，巨核细胞胞体大，胞质丰富，粒、红系细胞分化正常。BMB有核细胞增生程度在正常范围或极度活跃，粒、红系细胞形态及各阶段细胞比例大致正常。巨核细胞数量多、胞体大、胞质丰富和核分叶多是其特征。本病50%以上有JAK2V617F基因突变，无胶原纤维增生或网状纤维增多是其与PMF的主要区别。结合相关病史及基因检查排除继发性血小板增多可诊断原发性血小板增多症。

2.7PMFPMF是一种不明原因的造血干细胞异常所致的骨髓巨核细胞和粒系细胞克隆性增殖性疾病。90%以上有脾肝肿大和贫血，白细胞和血小板多少不定，外周血偶可见幼稚粒、红系细胞。BMA常干抽或混血。BMB示胶原纤维组织明显增生（纤维化期），网状纤维染色阳性（≥＋＋＋）［12］。所以BMB是诊断PMF的金标准。如未见胶原纤维增生，网状纤维（＜＋＋），轻度脾肿大，偶可中度肿大，排除淋巴细胞肿瘤后可诊断PMF，纤维化前期。

2.8淋巴瘤侵犯骨髓淋巴瘤从原发部位扩散转移到骨髓，可仍然保留原发瘤的组织结构模式、免疫表型和基因特征，因此，可根据BMB HE染色组织形态所显示的浸润淋巴细胞的大小，形态单一性或多形性，散在性或是密集分布（结节状或片状），结节状分布于小梁旁或是骨小梁间，然后结合免疫组化用相应的抗体染色，结合流式细胞分析，有时需结合IgH 和TCRγPCR基因重排对淋巴细胞侵犯骨髓来进行诊断和分型［13］。而BMA在没有临床病史情况下易把异常淋巴细胞归类为分类不明细胞，不能进行分型和确诊，在诊断上BMB优于BMA，但需两者相结合可提高检出率［14］。需要说明的是同一患者如流式细胞术显示少量B或T淋巴细胞单克隆性增生，而骨髓活检组织仅见少量成熟淋巴细胞小簇，小灶，单灶性，甚至多灶性分布（免疫组化显示B或T阳性），如没有原发瘤证据，并不能诊断淋巴瘤侵犯骨髓。因为单克隆增生不等于肿瘤，但肿瘤一定是单克隆性的。

2.9浆细胞性骨髓瘤浆细胞性骨髓瘤是发生在骨髓的多灶性浆细胞肿瘤，以血清和尿中出现大量的M蛋白为其特征。由于瘤细胞多灶性分布，BMA有时不能观察到骨髓瘤细胞，而BMB是诊断本病的强项，结合免疫组化CD138、CD38、CD79a或MUM1多灶、片状密集阳性可确诊。但有时还必须结合血和／或尿免疫球蛋白电泳及免疫固定电泳结果以及骨骼影像学检查诊断［8］。

3　骨髓转移性肿瘤

骨髓转移性肿瘤是指发生在非造血组织的恶性肿瘤从原发部位经过血管或淋巴管等扩散到骨髓形成的实体性肿瘤。据文献报道骨髓涂片检出率为28%～72%，骨髓活检检出率为35%～97%［15］，骨髓活检优于骨髓涂片，两者结合可提高检出率［16］。骨髓活检是诊断骨髓转移瘤的金标准［17］，不但可以明确肿瘤的性质、类型及分化程度，结合免疫组化及相应的抗体染色不但可确定肿瘤性质，还可提示肿瘤的原发部位：如CA15－3和Calponin（乳腺癌），AFP和Hepa（肝癌），CA72－4和Villin（胃肠癌），CA125（卵巢癌），PSA和P504S（前列腺癌），TTF－1和TG（甲状腺癌），CA19－9（胰腺癌）等抗体。根据网状纤维染色，还可以区别是转移性肉瘤还是转移性癌。

4　根据外周血涂片光镜检查结果诊断或提示传染病和血栓性疾病

4.1黑热病黑热病是杜氏利什曼原虫所引起的由白蛉传播的慢性传染病。骨髓涂片找到利杜体为诊断该病的金标准，而骨髓活检找不到利杜体，可能与涂片和染色方法不同有关，例如血小板在骨髓涂片中很清楚，而在骨髓切片中是看不到的［9］。

4.2血栓性血小板减少性紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）患者外周血涂片瑞氏染色异常红细胞特点：盔形红细胞、三角形红细胞、成熟嗜多染红细胞、小球形红细胞、少量幼红细胞及晚幼红细胞和血小板极少等。随后进一步结合相关实验检查和临床表现存在“五联征（依次为①血小板显著减少，②溶血，③神经系统症状，④肾脏异常，⑤发热）”即可诊断本病［10］。以上说明血细胞形态检查的重要性。

骨髓活检和骨髓涂片在血液病诊断中各有其优缺点，骨髓活检比骨髓涂片更能反映骨髓增生程度，骨髓活检可以观察骨髓细胞、脂肪细胞、骨小梁、血管形态、纤维组织增生等情况，对铁的储存状态判断更准确，但对血细胞形态中的胞质和胞核等细微结构难以判断。骨髓涂片取材方便，细胞形态清晰，便以操作，但取材量少，反映面窄，由于其他原因不易抽取或者“干抽”。总之，两者相互结合，互为补充，取长补短，方可提高造血系统疾病诊断的准确性。

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（本文编辑：李霦）

作者单位：745700庆阳市，甘肃省环县人民医院内科（蔺金军），检验科（赵鸿薇魏军龙）300384天津市，天津金域医学检验所病理诊断中心（陈辉树）

通讯作者：陈辉树，E－mail：chenhsh＠sina.com.cn