同型半胱氨酸的检测方法及临床应用的研究进展

曾风华综述，王小中审校

（1、吉安市青原区人民医院检验科，江西吉安343009；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006）

同型半胱氨酸的检测方法及临床应用的研究进展

曾风华1综述，王小中2审校

（1、吉安市青原区人民医院检验科，江西吉安343009；2、南昌大学第二附属医院检验科，江西南昌330006）

同型半胱氨酸是半胱氨酸代谢的中间产物，其代谢异常所导致的高同型半胱氨酸血症己被证实与冠状动脉粥样硬化、中风、高血压、冠心病等心脑血管疾病、神经系统退行性疾病、肥胖、慢性肾病以及缺铁性贫血相关。本文将简要介绍有关同型半胱氨酸和半胱氨酸的一些新的检测方法和同型半胱氨酸在某些疾病治疗中的研究进展。

同型半胱氨酸；检测方法；心脑血管疾病；神经退行性疾病

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种α-氨基酸，通过一些酶及辅助因子（B6，B12或叶酸）的作用，能够转化为甲硫氨酸或半胱氨酸（cysteine，Cys）［1］。维生素在Hcy的代谢过程中起到很重要的调节作用，除此之外运动、饮食习惯、性别和年龄都对Hcy的水平有显著的影响［2］。当生物体内的一些关键酶基因被改变时，Hcy的代谢途径会受到影响，导致Hcy增多，血液中Hcy处于高水平状态，称作高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy），我国一般将空腹总Hcy血浆浓度＞10μmol/ L定义为HHcy［3］。高浓度的Hcy通过MAPK/ERK激酶1/2和核因子κB来降低ApoE的表达［4］，是许多疾病的危险因子，特别是冠状动脉粥样硬化、高血压、冠心病、中风和痴呆等心脑血管疾病，并且它还会导致肥胖、糖尿病、慢性肾炎以及神经组织退化性疾病［5-7］。除此之外，血浆Hcy浓度还与严重脑损伤和预后情况、细胞的衰老以及肢干发育有关［8，9］。因此，Hcy的检测疾病的控制和治疗具有重大的意义。本文就对近年来有关Hcy所提出的一些新的检测方法以及Hcy在某些疾病中的临床意义做出综述如下。

1 Hcy的检测方法

1.1 放射酶分析法放射酶分析法是最早应用于测定血浆中Hcy的方法，其原理是Hcy在相关水解酶作用下，与14C标记的腺苷反应，生成具有放射性的S-腺苷-L-Hcy，然后在高效液相色谱技术下进行定量分析。该方法敏感性和特异性均尚可，能够检测出尿液标本中Hcy浓度，但操作方法较繁琐，检测试剂具有放射污染，对人体有危害，因此这限制了该方法的推广使用。

1.2 氨基酸分析仪检测法该方法的检测原理主要为：标本经过二硫苏糖醇或者2-巯基乙醇还原后，直接在氨基酸分析仪上进行检测，检测方式为茚三酮反应。该方法耗时长，灵敏度低，并且对含硫氨基酸不敏感，因此临床上基本不采用此方法检测血浆Hcy［10］。

1.3 气相色谱-质谱法（GC-MS）利用GC-MS联用检测血浆Hcy是由Stabler等在1987年首先报道的［11］，该方法特异性强、灵敏度高，并且重复性较好。然而由于其要求的设备先进、价格昂贵，并且操作十分复杂，耗时较长，因此在临床化学实验室中难于普及。

1.4 高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法检测Hcy是近年来应用最广泛的的方法之一，包括荧光法和电化学法，其中最常用的是柱前衍生化荧光法。自从1993年Fiskerstrand等首次采用HPLC法检测Hcy后［12］，经过不断改进和完善，该方法具备了良好的敏感性、精确度和特异性，加快了样本的检测速度，并且能够检测血浆、尿液、内腔积液等样本中的Hcy浓度［13］。该方法的关键步骤是荧光的标记，目前常用的荧光标记物主要有荧光探针和染料。

1.4.1 P-acid-aldehyde（P-CHO）荧光探针（P-CHO）是一种高敏感性和选择性的荧光探针，可用于检测Hcy。这一类探针主要利用醛基与巯基结合，形成一个稳定的π键共轭物质，从而达到检测到效果。这种方法可以在有其他氨基酸干扰的条件下高选择性地检测出Hcy，已经被成功应用于活细胞中Hcy的检验［14］。

1.4.2 DPP-AC荧光探针DPP-AC是一种基于吡咯并吡咯二酮（diketopyrrolopyrrole，DPP）和丙烯酸脂acrylate的荧光探针，可用于检测生物体内的巯基，具有高选择性和高敏感性。DPP-AC依靠丙烯酸脂的强电子吸附能力来改变荧光的参比率，其中I552/I664的荧光参比率的改变高达20倍。它可以在活细胞中很好的将Hcy区分出来［15］。

1.4.3 荧光素tri-aldehyde荧光素tri-aldehyde被设计用于检测人血浆中的Hcy，它同样通过PET来对样品进行区分，这种方法具有很高的灵敏性和选择性。在pH=6.0的条件下，在3个强电子吸附基团——醛基的存在下，荧光素能更好地与Hcy反应，从而提高Hcy的检测限［16］。

1.4.4 BODIPY荧光染料BODIPY是一种高色度选择性的荧光染料，可用于检测Hcy。与其他方法所不同的是，它是一种“裸眼染料”，在methanol-HEPES buffer溶液中，这种染料能将Hcy从其他氨基酸以及含巯基物质中鉴别出来从而用于Hcy的活细胞成像［17］。

1.5 循环酶法由于Hcy检测试剂盒的逐步市场化和大众化，全自动生化仪上已经广泛应用于临床中Hcy的检测。其原理主要是：样本中结合的Hcy被还原成游离的Hcy，然后在相关酶作用下最终分解成Hcy和丙酮酸，丙酮酸参与NADH的显色反应，而生成的Hcy再次循环至第一步反应，最终Hcy的含量与NADH的变化成正比。由于全自动生化仪的发展，循环酶法检测Hcy更加方便，操作简答，成本也较低，重复性好，因此具有广泛的应用前景［18］。

1.6 其他方法常见的Hcy检测方法还包括ELISA法、荧光偏振免疫法和高效毛细管电泳法，但这些方法灵敏度、特异性均不理想，并且操作较复杂，因此目前临床上已较少使用，趋于淘汰［19，20］。

2 Hcy在临床中的应用

2.1 Hcy与冠状动脉粥样硬化有研究发现，Hcy是动脉粥样硬化的独立危险因素，高浓度的Hcy能提高同型半胱氨酸蛋白糖浓度，进而增强炎症反应，形成动脉粥样硬化［21］。Hcy参与动脉粥样硬化的机制目前尚未完全明确，但可能与其诱导血管内皮细胞损伤、加速血栓形成、促脂质氧化、促血管平滑肌细胞及促炎症反应有关［22］。因此检查患者Hcy血浆浓度对冠状动脉粥样硬化的预防和诊断具有重要的意义。

2.2 Hcy与脑血管疾病当体内的Hcy水平代谢出现紊乱时，高浓度的Hcy可与低密度脂蛋白形成复合体，堆积于血管内，并且Hcy可发生自发氧化形成超氧化物，导致血管内皮细胞的损伤，最终引起心脑血管疾病。大量研究表明，高Hcy与脑血管疾病的发生具有相关性［3，23，24］。Hcy浓度高的患者患脑卒中的概率要明显高于Hcy浓度正常者［25-27］。

2.3 Hcy与神经组织退化性疾病Hcy是一种含硫的促炎症氨基酸，当机体出现神经退行性疾病时，比如肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS），Hcy的浓度会显著上调。医学界普遍认为，高浓度Hcy通过增加氧胁迫来导致神经退行性疾病［28］。Letizia Polito等人的研究表明，总同型半胱氨酸水平对老年人的认知受损有影响，高水平的Hcy可能与执行功能受损有关，并且高浓度Hcy会导致一些危险的神经毒性物质的产生，从而损伤认知功能［29］。

2.4 Hcy与肾病高水平的Hcy能够通过增加血管氧胁迫压力，并降低机体的抗氧化能力，从而导致慢性肾炎的发生。有研究表明，较健康人而言，慢性肾炎患者体内有更多的丙二醛以及更强的抗氧化潜力，但是抗氧化酶的活性却显著性下降；高浓度的Hcy以及丙二醛会增加病人患慢性肾炎的风险［30］。Chico等人的研究表明，非胰岛素依赖型糖尿病病人Hcy水平高于对照组，并得出糖尿病病人空腹Hcy升高和白蛋白排泄率增高有关［31］。因此，监测Hcy水平对肾病的预防与治疗也是十分必要的。

2.5 Hcy与冠心病高浓度的Hcy能够抑制脂蛋白合成，增加机体内低密度脂蛋白胆固醇，进而抑制胆固醇的转运，提高动脉粥样硬化的危险性［32］。有研究表明，在冠心病患者体内，血浆腺苷浓度、Hcy浓度以及血尿酸浓度要显著高于健康者，并且腺苷浓度与Hcy和血尿酸浓度具有相关性［33］。但腺苷到底如何参与疾病的调控或者说他是否是一种保护性调节还有待进一步研究。

2.6 Hcy与肥胖有研究表明，Hcy浓度还与肥胖有关，研究中作者选取了238名3岁左右的孩子，对他们身体的各项指标进行了监测与评估，发现Hcy水平与患者肥胖程度相关［34］。这项研究为肥胖的治疗提供了一种新的思路——在早期就对肥胖的潜在患者进行Hcy浓度的干预。杨帆等人的研究也表明，Hcy水平升高能改变肝脏的脂肪代谢，从而影响肥胖的产生［35］。

2.7 Hcy与缺铁性贫血罗小琴等人发现，严重的高Hcy血症患者，会出现缺铁性贫血以及过量铁离子在肝脏中沉淀。于是她们在HepG2细胞中对Hcy影响铁调素的表达进行了研究，结果显示铁调素的翻译以及蛋白的表达对Hcy呈现出一种剂量依赖性［36］。这也为难治性缺铁性贫血提供了新的治疗思路。

小结

同型半胱氨酸在人体内具有重要的生理功能，包括参与甲硫氨酸代谢、调节体内甲基化等，但异常浓度的Hcy与心脑血管疾病、神经系统疾病、肾病等疾病的发生存在密切关系。其中，高Hcy血症已被大家公认是心脑血管疾病的一个危险因素。Hcy的检测手段也多种多样，目前应用较为广泛的方法主要有高效液相色谱法以及循环酶法。随着全自动生化分析仪的发展和普及，循环酶法检测Hcy已成为临床中最为方便、实用，这也为Hcy检测的临床常规化提供了必备条件，为临床上心脑血管疾病的控制和治疗提供了一定帮助。

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R446.11+2

A

1674-1129（2016）05-0601-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.020

2016-05-05；

2016-08-24）

曾风华，女，1974年3月出生，主管技师，主要研究方向临床生物化学诊断。

王小中，男，1973年12月出生，教授，主要研究方向为血液病分子机制及诊断。