福建泰宁野生铁皮石斛ISSR亲缘关系分析

江金兰，叶 炜*，李永清，范志敏，雷伏贵(.三明市农业科学研究院药用植物研究所,福建沙县 365509; .福建泰宁红石山生态农业科技有限公司,福建泰宁 354400)



福建泰宁野生铁皮石斛ISSR亲缘关系分析

江金兰1，叶 炜1*，李永清1，范志敏2，雷伏贵1
(1.三明市农业科学研究院药用植物研究所,福建沙县 365509; 2.福建泰宁红石山生态农业科技有限公司,福建泰宁 354400)

摘 要：利用ISSR分子标记技术对158份福建省泰宁县野生铁皮石斛(Dendrobium officinale)单株进行亲缘关系分析。结果显示,11条ISSR引物在158份样本中共扩增条带189条,多态性比率达91.7%,表明泰宁野生铁皮石斛样本间存在极为丰富的遗传多样性; UPGMA树状图分析显示,样本总体遗传距离介于0～0.58,在遗传距离0.43处,158份福建省泰宁野生铁皮石斛样本被分为4个类群,具有较高的物种多样性。

关键词：铁皮石斛;亲缘关系; ISSR;遗传多样性

DOI 10.16178/j.issn.0528-9017.20160221

铁皮石斛(Dendrobium officinale)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物,生于海拔1 600 m的山地半阴湿的岩石上,喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境。铁皮石斛主要产于安徽西南部、浙江东部、福建西部、广西西北部、四川、云南东南部等地［1］。因生长周期缓慢,野生铁皮石斛极难存活,已被列入重点保护的珍稀濒危药用植物。铁皮石斛因表皮铁绿色而得名,具有独特的药用价值,以其茎入药,属补益药中的补阴药,《中国药典》指其具有益胃生津、滋阴清热的功效［2］,现代医学指其拥有增强免疫功能、降低血糖血脂、抗肿瘤、滋养肌肤、抗衰老等功效。

福建省地处东南沿海,为南亚、中亚热带气候区的交叠地带,境内武夷山、戴云山两大山脉的屏障及台湾海峡暖流作用,形成地形复杂、雨量充沛的地理环境,为石斛属植物的生长提供了极佳的生境［3］。泰宁县位于武夷山脉中段的杉岭支脉东南侧,海拔落差大,境内大量丹霞地貌以丘陵及山地形式分布,蕴藏有丰富的野生铁皮石斛资源,并在外观上与现有铁皮石斛栽培品种呈现丰富的多样性。DNA分子标记技术作为传统分类的补充,可减少由于形态描述和环境条件产生的误差,从分子水平鉴定个体和群体间的差异; DNA分子标记技术在石斛上的应用主要集中在遗传稳定性［4-6］、种间鉴定［7-11］以及野生居群分析［12-19］等方面。本研究以福建省泰宁县采集的158份野生铁皮石斛单株为试验材料,利用ISSR分子标记技术对其遗传多样性及亲缘关系进行分析,了解福建泰宁野生铁皮石斛的生物多样性,对该地区野生铁皮石斛资源的保护和利用具有重要的理论和现实意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料

本试验所用的材料为从福建泰宁采集的野生铁皮石斛单株158份(部分样本如图1),由福建泰宁红石山生态农业科技有限公司提供。

1.1.2生化试剂

Taq酶和Marker购自上海宝生物工程有限公司,琼脂糖、SDS、ISSR引物购自上海生工生物工程技术服务公司。

1.2方法

1.2.1DNA的提取

采用改良CTAB小量法提取铁皮石斛叶片的总DNA。具体步骤为:取幼嫩叶片0.1 g,加液氮研磨至粉末状,转移至2 mL离心管中;加800 μL 70℃预热的提取缓冲液,振荡混匀,于70℃水浴锅温浴5～10 min,期间不时轻摇;加入400 μL氯仿,颠倒混匀3～5 min; 12 000 g,4℃离心5 min,弃上清,用75%预冷的乙醇漂洗2次;晾干,加入50 μL ddH2O,常温下溶解; -20℃中保存备用。1.2.2 ISSR引物筛选及扩增

图1　福建泰宁野生铁皮石斛的部分单株

随机抽取3个铁皮石斛样本混合,对100条随机ISSR引物进行初步筛选,筛选出清晰、重复性好的ISSR引物,再用所有铁皮石斛的DNA样本进行进一步筛选,最终筛选出条带丰富、清晰的ISSR引物11条作为正式扩增的引物(表1)。

ISSR-PCR扩增反应体系20 μL:ddH2O 9 μL,2×Taq MasterMix 9 μL,引物1 μL,模板DNA 1 μL。ISSR-PCR扩增程序:94℃预变性4 min,94℃变性45 s,不同退火温度下退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环,72℃延伸10 min,4℃保存PCR产物。2%琼脂糖凝胶电泳分离扩增电泳产物,EB染色,凝胶成像系统观察结果并拍照记录。

1.3数据统计与分析

1.3.1数据统计

ISSR扩增产物经成像仪拍照,同一引物扩增、电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性,利用人工方法进行统计,将扩增产物在相同迁移位置清晰的条带赋值为1,没有或不易分辨的条带赋值为0,用Excel建立原始数据矩阵。

1.3.2数据分析

数据采用DPS 7.05软件进行聚类分析,生成UPGMA (un-weighted pair group method with arithmetic mean)聚类图。

2　结果与分析

2.1ISSR标记扩增结果

从100条ISSR引物中筛选出11条条带丰富清晰的ISSR引物(表1),利用这些引物对158份福建泰宁野生铁皮石斛单株进行ISSR-PCR扩增。结果(图2)表明,11条引物共扩增条带189条,多态性比率达91.7%,单条引物扩增的多态性条带数在12～22,平均17.2条,其中扩增出最多条带的引物是I73,共扩增出条带22条,ISSR扩增产物的分子量大多在100～2 500 bp。

表1　ISSR分子标记引物

2.2福建泰宁野生铁皮石斛样本聚类分析

PCR扩增结果采用Excel按0和1记录后,使用DPS 7.05软件分析其遗传距离,得到UPGMA亲缘关系的树状图(图3)。结果表明,样本间遗传距离介于0～0.58;在遗传距离0.43处,158份福建省泰宁野生铁皮石斛样本被分为4个类群,第Ⅰ类群为样本41,54,113号,第Ⅱ类群为135,151号,第Ⅲ类群为64,153号,第Ⅳ类群为其余151份样本,其中,仅4号和52号、139号和161号、115号和121号、207和215号、208和212号、46和81号之间的遗传距离较近,其余样本间呈现较大的遗传距离。

图2　ISSR引物I73 PCR扩增图谱

图3　福建泰宁野生铁皮石斛样本的UPGMA聚类分析树

3　讨论

福建省是铁皮石斛的原产地之一［2］,据林建丽［3］对福建省野生石斛属植物分布及生境调查研究发现,铁皮石斛多分布在邵武、宁化、泰宁、建宁、将乐等地。虽然泰宁县野生铁皮石斛的民间采集与利用历史悠久,但对该地区的铁皮石斛的种质资源多样性的调查与分析还未见报道。丁鸽等［17-18］利用RAPD和SRAP标记技术对不同居群铁皮石斛的遗传多样性进行评价,结果表明铁皮石斛种内多态性水平较高,可达91.35% (RAPD)和88.01% (SRAP);包英华等［19］利用SRAP技术分析8个居群铁皮石斛的遗传多样性,结果表明铁皮石斛种质资源遗传多样性水平较高,总多态性条带比率为96.46%。本试验以源自福建省泰宁县158份野生铁皮石斛单株为材料,利用ISSR分子标记技术,从100条引物中筛选出11条条带丰富清晰的ISSR引物,利用这些引物对158份福建泰宁野生铁皮石斛单株进行ISSR-PCR扩增,共扩增条带189条,多态性比率达91.7%,该结果与前人的研究结果基本一致。

从聚类分析的结果看,源自福建泰宁的158份野生铁皮石斛样本间遗传距离介于0～0.58之间,在遗传距离0.43处,158份福建省泰宁野生铁皮石斛样本被分为4个类群,表明虽然泰宁野生铁皮石斛各样本源自同一地区,但是各样本间呈现较为复杂的遗传结构。本研究结果表明,泰宁野生铁皮

石斛种群具有丰富的遗传多样性,但由于近年来破坏性采集,野生资源急剧减少,对本地区野生铁皮石斛进一步的研究和保护具有重要的现实意义。

参考文献:

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:中国医药科技出版社,2010:265-266.

［2］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第十九卷［M］.北京:科学出版社,1999:117.

［3］林建丽.福建省野生石斛属植物分布及生境调查研究［J］.林业勘察设计,2009 (2):13-16.

［4］杨春勇,李学兰,王云强,等.人工栽培石斛的ISSR标记分析［J］.中国农学通报,2011,27 (4):148-152.

［5］李霞,何涛,淳泽,等.石斛组培苗遗传差异性ISSR检测［J］.应用与环境生物学报,2013,19 (2):249-254.

［6］江金兰,叶炜,李永清,等.同源四倍体铁皮石斛的生长及多糖积累［J］.植物生理学报,2014,50 (4):519-526.［7］沈颖,徐程,万小凤,等.ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用［J］.中草药,2005,36 (3):423-427.

［8］沈洁.DNA序列、ISSR标记在药用植物种质鉴别中的应用［D］.南京:南京师范大学,2005.

［9］沈颖.石斛类ISSR标记研究与ITS序列分析［D］.杭州:浙江大学,2004.

［10］卢家仕,卜朝阳,吕维莉,等.20份兰科植物的ISSR遗传多样性分析［J］.西南农业学报,2012 (6):2252-2257.

［11］卢家仕,卜朝阳,吕维莉,等.不同产地石斛属种质资源的ISSR遗传多样性分析［J］.中草药,2013 (1):96-100.

［12］沈洁,丁小余,丁鸽,等.铁皮石斛居群差异的研究ⅡISSR指纹标记方法的建立与优化［J］.中国中药杂志,2006 (4):291-294.

［13］沈洁,徐慧君,袁英慧,等.铁皮石斛野生居群基于RAMP标记的遗传多样性评价［J］.药学学报,2011 (9):1156-1160.

［14］SHEN J,DING X Y,LIU D Y,et al.Intersimple sequence repeats (ISSR ) molecular fingerprinting markers for authenticating populations of Dendrobium officinale Kimura et Migo［J］.Biological & Pharmaceutical Bulletin,2006,29 (3):420-422.

［15］马佳梅,殷寿华.西双版纳地区流苏石斛遗传多样性的ISSR分析［J］.云南植物研究,2009,31 (1):35-41.

［16］曾淑华,萧凤回,查应洪,等.云南文山铁皮石斛居群的初步评价［J］.时珍国医国药,2012,23 (2):468-470.

［17］丁鸽,丁小余,沈洁,等.铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别［J］.药学学报,2005,40 (11):1028-1032.

［18］DING G,ZHANG D Z,DING X Y,et al.Genetic variation and conservation of the endangered Chinese endemic herb Dendrobium officinale based on SRAP analysis［J］.Plant Systematics and Evolution,2008,276 (3):149-156.

［19］包英华,潘超美,白音,等.铁皮石斛种质资源遗传多样性的SRAP分析［J］.北京中医药大学学报,2014,37 (5):349-353.

(责任编辑：张 韵)

通信作者:叶 炜(1980—),男,副研究员,博士,主要从事园艺植物生物技术研究工作,E-mail:yewei922@qq.com。

作者简介:江金兰(1973—),女,福建泰宁人,高级农艺师,主要从事园艺植物生物技术研究工作,E-mail:420465520@qq.com。

基金项目:国家级星火计划项目(2014GA720032);福建省种业创新与产业化工程项目(FJZZZX-1540);福建省三明市科技计划项目(2014-N-3);三明市农业科学研究院院立项目(2013-Y-01)

收稿日期:2015-09-15

中图分类号：S567

文献标志码：A

文章编号：0528-9017(2016)02-0208-03

文献著录格式:江金兰,叶炜,李永清,等.福建泰宁野生铁皮石斛ISSR亲缘关系分析［J］.浙江农业科学,2016,57 (2):208-210,213.