山茱萸科植物组织培养研究进展

2016-03-30南京林业大学林学院南京林业大学南方现代林业协同创新中心江苏南京210037

种子 2016年8期

，， (南京林业大学林学院，南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037)

·综述·

山茱萸科植物组织培养研究进展

杨寻，张洋，洑香香
(南京林业大学林学院，南京林业大学南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037)

山茱萸科植物是一类集观赏、食用、药用和材用于一体的多用途植物。掌握该科植物的组织培养技术，对其种质资源的开发、利用与保存具有重要意义。本文从外植体、基本培养基、植物生长调节剂和组培苗移栽等方面综述了山茱萸科植物组织培养的研究进展，并提出了在实际应用中所存在的相应问题及解决方法。

山茱萸科；组织培养；外植体；基本培养基；

山茱萸科(Cornaceae)为落叶乔木或灌木，稀常绿或草本，隶属于被子植物门双子叶植物纲蔷薇亚纲(Rosidae)山茱萸目(Cornales)。全世界共有15属，约119种，分布于全球各大洲的热带至温带以及北半球环极地区，以东亚最多。我国有9属，约60种，分别为梾木属(Svida)、山茱萸属(Cornus)、四照花属(Dendrobenthamia)、青荚叶属(Helwingia)、单室茱萸属(Mastixia)、鞘柄木属(Toricellia)、桃叶珊瑚属(Aucuba)、草茱萸属(Chamaepericlymenum)以及灯台树属(Bothroaryum)。除新疆外，其余各省区均有分布[1-2]。山茱萸科植物中的乔木，树形高大，树干挺拔，冠幅宽阔，枝叶茂盛，分枝较高，生长迅速，寿命长，其耐寒耐旱能力也较强，且对土壤和光照的要求较低，很适于作为行道树，如梾木(S.macrophylla)、光皮梾木(S.wilsoniana)、灯台树(B.controversum)、香港四照花(D.hongkongensis)等[3-4]。山茱萸(C.officinalis)是我国传统的珍贵中药材，味酸、微温，临床用其干燥果肉，具有补益肝肾、收敛固脱的功效[5]。多数梾木类的种子含油率高，是重要的燃料油资源，如光皮梾木与毛梾(C.walteri)是2种公认的油料树种，果实含油率均高于30%[6-7]，其中光皮梾木有望发展成为中国的“绿色生物燃料”[8-9]。偃伏梾木(C.stolonifera)、沙梾(C.bretchneideri)、小梾木(C.paucinervis)和红瑞木(C.alba)等灌木类还可作为优良材料应用于编织业[10]；四照花类植物用于园林观景可孤植在亭边、榭旁、堂前、山坡或丛植于路边、草坪、林缘池畔等处，可春赏亮叶，夏观玉花，秋看红果和红叶；其果可鲜食、酿酒和制醋，含有高脂肪和高钙，是一种有开发利用价值的野生水果[11-12]；鲜叶敷伤口可消肿，根及种子煎水服用可补血；其木材坚硬，纹理通直而细腻，易于加工，是良好的用材树种[13]。

山茱萸科植物多分布于一些深山老林等不易被人们发现的区域，严重影响了该科植物的开发利用和产业化进程。其传统的繁殖方式有种子繁殖和扦插、嫁接等无性繁殖方式。四照花类种子具有深休眠特性，自然条件下2年才能萌发[14-15]。梾木类一些优质高产的栽培品种都以杂合形式存在，种子繁殖变异率大；扦插繁殖存活率低；嫁接繁殖则需要繁重的劳力[16]。基于目前有些树种的开发利用，已培育出许多优良品种或无性系，如四照花属的栽培品种已达100多个，如东京四照花(D.tonkinensis)、秀丽四照花(D.elegans)、香港四照花(D.hongkon-gensis)和大花四照花(C.florida)等，其繁殖主要通过无性繁殖。其中组织培养技术不仅能有效地克服其传统育苗缺陷，而且繁育出的无性系苗木可保持亲本的优良性状。因此利用植物组织培养技术对山茱萸科植物的快速繁殖，保护其种质资源具有重要的意义。本文综述了近几十年来山茱萸科植物组织培养技术相关的研究，对外植体、基本培养基和植物生长调节剂等方面及培养过程中出现的主要问题和相应的解决方案进行了探讨。

1 影响山茱萸科植物组织培养的主要因素

将植物的离体器官、组织和细胞等放在培养基上进行培养，使其逐渐增殖、分化，并发育出完整的小植株是一个相当复杂的过程，其形态发生的过程必然受到许多因素和条件的影响制约。其中外植体、基本培养基和植物激素起到了关键性的作用。

1.1 外植体

1.1.1 外植体选择

在植物组织培养中，外植体的选择是最终培养能否成功的关键因素之一。外植体供体植株的发育阶段、年龄、生长环境及外植体取材部位等的不同均可导致外植体生理状态的差异，从而影响组织培养的形态发生[17]。

山茱萸科大部分树种都以茎尖[18-19]、带芽茎段[20-25]等为外植体，通过器官直接发生途径获得再生植株，通过这种方式获得的植株遗传变异小，能保持亲本的特性。其中，峨眉四照花(C.capitanavar.emeiensis)的幼嫩茎尖[18-19]、红瑞木的茎段[20-21]就容易诱导不定芽。

愈伤组织的诱导常选用叶片、茎尖、茎段、花托、花柄、顶芽等作为外植体。峨眉四照花[18-19]、灯台树[22]、山茱萸[23,26]、角叶鞘柄木(T.angulata.var.intermedia)[27]的叶片均已成功诱导愈伤组织。路承香等[18]曾用峨眉四照花茎尖诱导产生大量愈伤组织，诱导率达80.0%，但仍未进行下一步的分化研究。李焘[23]对山茱萸的花托、花柄进行愈伤组织的诱导，诱导率分别为100%、96.2%，将诱导出的愈伤组织进行增殖培养，大量增殖后部分可分化出不定芽，分化率可达54.8%。

体胚发生最适合用未成熟的外植体诱导。Trigiano 等[28]利用大花四照花的未成熟合子胚，在MS[29]或Schenk and Hildebrandt(SH)培养基上，以3(或5)mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT的激素配比组合成功诱导出胚状组织，但最后并未成苗。

1.1.2 外植体消毒

对外植体材料进行合理有效的消毒处理，是植物组织培养工作的重要环节。外植体是有生命的植物材料，因此要求在消毒过程中既能有效杀灭微生物，又不能损伤植物组织。外植体消毒主要采用化学药剂进行表面消毒，其关键在于灭菌药剂的选择和消毒时间的把握。不同的外植体类型和不同的取材时期导致灭菌药剂的选择和消毒时间的确定存在一定的差异。李卉[19]对野外采集的峨眉四照花外植体用饱和漂白精溶液+吐温-80法处理10 min，污染率较低，且植株褐化现象较轻。在山茱萸科组织培养试验的研究过程中，常用的灭菌组合为70%～75%酒精和0.1%升汞，消毒时间则因材料不同各异。其中，张明丽[20]在对金叶红瑞木外植体进行消毒时发现，用70%酒精20 s+0.1%升汞8 min组合污染率与褐化率降为最低。冯丽娜[22]在灯台树组培快繁的试验中比较了84消毒液(有效氯含量为4.8%～6.2%)及酒精和升汞组合的灭菌效果，结果显示20% 84消毒液灭菌15 min外植体成活率最高，为96.7%。

1.2 基本培养基

山茱萸科植物组织培养常用的基本培养基有：woody plant medium(WPM)[30]、MS、1/2 MS(MS中的大量元素减半)、B5[31]和DKW[32]等，其中最常用的是WPM和MS。

WPM、MS、1/2 MS、DKW、M(MS培养基添加CaCl21 200 mg/L)、1/2 M培养基等可用于不定芽的直接诱导。狭叶四照花于WPM培养基上成功完成了不定芽的诱导、增殖与生根[33]；Kaveriappa 等[34]用WPM培养基对大花四照花幼苗的茎段和顶端分生组织进行的组织培养首次获得了成功，诱导出丛生芽并获得了生根植株；MS培养基则应用于峨眉四照花[18-19]、红瑞木[20-21]、山茱萸[23]等植物的不定芽诱导。Li等[25]发现用DKW培养基诱导光皮梾木的带芽茎段产生不定芽的效果最好，褐化程度最低；WPM、M和1/2 M培养基分别用于灯台树不定芽的诱导、增殖与生根[22]。

MS和B5培养基等可用于愈伤组织的诱导。峨眉四照花茎尖在MS培养基上诱导产生了大量愈伤组织，诱导率达80.0%[18]；同样灯台树叶片在MS培养基上也诱导出了愈伤组织，诱导率高达100%[22]；B5用于诱导角叶鞘柄木的愈伤组织[27]。

MS与SH培养基等可用于胚状组织的诱导。大花四照花通过体胚发生途径在MS和SH培养基上添加植物生长调节剂2,4-D以及2,4-D与KT的组合，成功诱导了胚状组织[28]。

1.3 植物生长调节物质

1.3.1 对不定芽诱导与增殖途径的影响

外植体通过直接器官发生途径产生不定芽是相对快捷的方式。在植物组织培养的过程中，外源激素对外植体材料的形态建成与调控起着十分重要的作用，其不同种类的选择和浓度的配比又影响着植株的再生频率和再生方式[35-37]。山茱萸科植物较易诱导不定芽，各种植物生长调节物质的综合作用尤其是激素浓度的配比对不定芽的诱导和增殖有很大的影响。

植物细胞分裂素6-卞氨基嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、玉米素(ZT)与植物细胞生长素3-吲哚丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)或α-萘乙酸(NAA)等的特定组合及浓度配比可用于该科植物的不定芽诱导。以MS为基本培养基，较高浓度的激素水平可用于难以诱导出芽的树种；反之，较低的浓度则可用于易诱导出芽的树种，如，用2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IBA以及2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IBA可诱导峨眉四照花的茎尖产生不定芽[18]；0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA可诱导红瑞木茎段的不定芽[20]。以1/2 MS为基本培养基，0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA可用于偃伏梾木叶片的诱导，再生频率高达100%，不定芽在添加0.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA后能有效增殖[38]；0.5～1.0 mg/L 6-BA+0.05～0.10 mg/L IAA可诱导山茱萸的幼胚产生不定芽，其中平均每个幼胚可分化出6.7个芽，然后将6-BA与IAA的浓度降低1倍，再添加0.5～1.0 mg/L GA3可进行增殖培养，增殖系数为2.5[39]；1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA可诱导山茱萸茎段萌发腋芽[23]。以WPM为基本培养基，1.0 mg/L 6-BA可诱导大花四照花丛生芽的增殖[34]；狭叶四照花诱导与增殖的植物激素分别为1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA和1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，萌发率达到86.29%，增殖系数为4.07[33]；0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L GA3有利于灯台树新梢的启动[22]；2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA可使山茱萸的茎段侧芽形成丛苗[24]。以M为培养基，0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA可用于红瑞木不定芽的增殖培养，增殖率为73.5%，增殖系数为2.32[20]；对于灯台树，适宜的增殖激素组合为1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+2.0 mg/L GA3，平均增殖系数为4.4[22]；以DKW为培养基，0.5(或1.0) mg/L ZT+0.1 mg/L IBA可用于光皮梾木不定芽的诱导，平均出芽数量为2.12，而0.5 mg/L ZT+0.1 mg/L IBA则可使其不定芽增殖系数达最高，为4.22[25]。

1.3.2 对愈伤组织诱导与分化途径的影响

山茱萸科植物外植体还可通过器官间接发生的途径产生再生植株，即先经过脱分化形成愈伤组织，再进一步分化形成不定芽。

6-BA和IBA、NAA、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等常用于该科愈伤组织的诱导与分化。其中NAA和2,4-D对愈伤组织的诱导具有十分重要的作用。以MS为基本培养基，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA可诱导峨眉四照花的茎尖产生大量愈伤组织，诱导率达80.0%[18]；0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA可使灯台树的叶片出愈率达100%，其愈伤组织质地松软，米白色至浅绿色，生长良好[22]。以1/2 MS为基本培养基，李焘[23]经研究发现，有利于山茱萸叶片愈伤组织诱导的激素组合为1.0 mg/L 6-BA+0.5～1.0 mg/L IBA，2,4-D则适于花柄、花托愈伤组织的形成，例如1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D可诱导花柄、花托产生愈伤组织，其中花托的出愈率达100%；裴莉昕等[26]通过试验证明，1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA是诱导山茱萸叶片产生愈伤组织的最佳组合；陈惠等[40]从试验中得出，0.5～1.0 mg/L激动素(KT)+0.05～0.50 mg/L NAA对山茱萸叶片、顶芽、幼果、果柄等产生愈伤组织的诱导效果十分显著，并指出NAA浓度越高，愈伤组织产生量就越大。以B5为基本培养基，角叶鞘柄木在激素组合0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D中产生愈伤组织且生长良好[27]。

1.3.3 对体胚发生途径的影响

从近几十年的研究结果来看，对山茱萸科植物体细胞胚胎发生的研究较少。2,4-D和KT等植物生长调节剂可用于体胚发生。Trigiano等[28]利用大花四照花的未成熟合子胚，以MS或SH为培养基，3(或5) mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT完成了对胚状组织的诱导，但最后并未成苗。

1.3.4 对壮苗和生根的影响

影响植物离体培养过程中壮苗和生根的因素有很多，包括外植体自身的生理生化状态，也有外部的多种因素，如基本培养基、植物激素、培养途径、光照、pH值和温度等的影响。

芽苗的生根与它的健壮程度有关，即生根前的壮苗培养很有必要[41]。山茱萸科植物壮苗和生根培养所选用的植物激素有IBA、NAA、钾盐吲哚丁酸(KIBA)等。以1/2 M为基本培养基，0.5 mg/L IBA可使红瑞木生根率达91.7%，移栽成活率达78.9%[20]；3.0 mg/L IBA可诱导灯台树生根，暗培养10 d，生根率为60.0%[22]。以1/2 MS为基本培养基，0.5 mg/L IBA可诱导偃伏梾木生根[38]；1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L 6-BA可使山茱萸生根率达60.0%以上[24]。以WPM为基本培养基，1.0 mg/L IBA 可诱导大花四照花生根[34,42]；1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA有利于山茱萸的丛苗进行壮苗培养[24]；以DKW为培养基，1.0 mg/L KIBA 可诱导光皮梾木生根，生根率高达93.3%，平均根长有2.8 cm[25]。

1.4 炼苗与移栽

组培苗是在恒温、保湿、营养丰富、光照适宜和无病虫害侵染的优良环境中生长的，其组织发育程度不佳，抗不良环境能力差。移栽时，由于环境条件变化，常会因组织失水和病菌感染而引起组培苗死亡。因此，移栽时要重点防失水、防感染。移栽前3～7 d，打开瓶盖炼苗，炼苗后用自来水洗掉根部培养基，以防病菌感染。

已报道的山茱萸科植物组培苗移栽成活率为70%～100%。灯台树的炼苗时间为3 d，移栽于消毒的混合基质中，用水浇透，置于20～25 ℃的温室内，湿度保持在90%以上，试验得出以蛭石∶珍珠岩=1∶1(体积比)为移栽基质成活率高[22]。狭叶四照花在炼苗7 d移栽至草炭土∶蛭石(1∶1)的基质中培养成活率高[33]。

2 山茱萸科植物组织培养中存在的问题

2.1 褐化问题

山茱萸科中的部分植物酚类物质含量较高，当细胞膜的结构发生变化与破坏时，这些物质相互接触之后发生一系列反应，并形成有毒害的褐色物质，一般来讲，组织的褐化是一系列酶的作用所致，有多酚氧化酶、过氧化酶以及L-苯丙氨酸解氨酶，即酶促褐变[43-44]。当外植体褐化后，如果不加以控制，常会造成外植体死亡。褐化程度随植物的基因型、外植体大小、取材时间、取材部位、损伤程度、培养条件、培养基配方以及抗褐化剂添加等因素而不同。

在培养基中加入Vc可有效地防止组织褐化[45]。多胺、蛋白水解产物等物质也可作为抑制剂防止褐变的发生[46]。选择合适的灭菌药剂和消毒方法，适当降低培养基的pH值，适当降低培养基中无机盐的浓度，适当低温，降低外植体接种密度，缩短转瓶周期等也可减轻褐化的发生。有一些研究表明光照也能影响褐化，但对于不同植物种类所表现出的规律不同，甚至相反[47]。光能促进多种植物组织培养中酚的氧化，在低光照或置于黑暗中培养一段时间能减轻褐变。同时应注意，一些因素具有多重影响，如活性炭能防止褐化，但也能吸附培养基中的一些其他有机物，所以在添加活性炭的培养基中应适当调整激素配比使其维持在适宜的水平。有研究表明，随着气候的变化，气温的升高，四照花茎尖所分化的醌类物质可能增加，褐变率也随之增高[18]。Li等[25]在试验中发现，在对光皮梾木进行组织培养中，未添加任何抗褐化剂的组培苗褐化率为100%，添加300 mg/L的活性炭后褐化率降到61.7%，而300 mg/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)则可使褐化率降到18.3%。

2.2 污染问题

污染问题是山茱萸科植物组织培养中经常遇到的难题，污染物常出现在外植体表面、附近的培养基及其他位置，表现为浑浊、霉变、粘液状等形状，污染物的颜色有黄色、乳白、黑色、红色等。造成污染的原因较多，如外植体带菌、工作环境及仪器、培养基及器皿消毒不彻底、操作不规范等。造成污染的病源主要可分为细菌和真菌两大类[48-49]。

控制污染可从以下两个方面入手：一方面，控制外植体材料自身带菌。选择最佳的取材时间以及生长良好的外植体，然后经过一系列的消毒处理可以降低到可接受的程度；然而外植体内部带菌(内生菌)是不易清除的，但也可对外植体进行前期预培养来加以控制；另一方面，操作污染和环境污染。理论上，这类污染可通过规范操作程序，把污染控制在可接受的范围。

山茱萸科部分植物在培养过程中较易出现内生菌污染的问题。内生菌分为内生细菌和内生真菌。内生真菌主要属于子囊菌和半知菌，少数为担子菌和卵菌，它们均生活在健康的植物体内不能引起任何病害症状[50-51]。在植物组织培养中，由于外植体材料内部的内生细菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料一并带入组织培养过程，随培养过程的变化引起程度不一的污染，称为内生细菌污染[52]。一些研究认为，植物组织培养中的细菌污染是休眠细菌芽孢萌发的结果，可以通过在培养基中添加抗菌素、降低pH值或者茎尖培养等措施防治和减少内生菌污染[53]。

2.3 玻璃化现象

在继代培养和快速增殖中，有时会出现一种组培苗变成肿胀、半透明、易折断的畸形苗现象，即是玻璃化现象。玻璃化苗的分化能力较低，难以增殖生根成苗，成苗之后也会因生理功能异常而难以移栽成活。一般认为培养基与培养条件不平衡、不适宜是发生玻璃化的主要原因。

目前有一些控制玻璃化的方法，如适量减少分裂素而增加生长素的量；适当增加光照以及适当增加无机盐；采用固体培养基时，适当增加琼脂的量；高温季节要有降温措施以及使用透气良好的封口材料等方法，都可以有效减轻试管苗的玻璃化现象[54]。从金叶红瑞木组培快繁的试验中得出，增殖培养过程中，把培养基中的琼脂浓度增加到0.8%，蔗糖浓度增加到4%，用通气性好的塑料薄膜封口，培养基灭菌后放置4，5 d再接苗，把转接的苗放到昼夜温差9～11 ℃的培养条件下培养，可克服玻璃化现象[20]。

3 展望

对山茱萸科植物组织培养的研究多数仍处于探索阶段。大多数植物的出芽率、增殖系数、生根率等都较低，离实际应用还有较大的差距，尤其是对体细胞胚胎发生方面的研究还很空白，难以建立一套完整、高效的组织培养再生体系。山茱萸科植物具有很高的观赏价值及经济价值，其组织培养方面还有十分广阔的空间，因此，对该科的不同属、不同种的植物都应加强研究，找到适合各种的再生体系，提高它们的利用价值，对种质资源的保护也具有极大的意义。

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