葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——花粉辐射和离体胚挽救技术

黄金华，董彦琪，刘喜存，王文英,王玲艳，朱红彩

（河南省新乡市农业科学院 河南新乡 453000）

辐射花粉授粉和离体胚挽救技术是用射线辐射瓜类即将开花或正开花的雄花花粉，然后给去雄的雌花授粉影响其受精进而诱导其产生单倍体胚，再通过离体胚挽救获得单倍体植株[1-6]。辐射花粉授粉和离体胚挽救技术是获得葫芦科作物单倍体（Haploid）和双单倍体（Double haploid，DH）的主要途径之一。利用该技术可快速获得纯系、缩短育种周期、加速育种进程。本文侧重综述了该技术的一些重要影响因素，如基因型、辐射剂量、辐射剂量率、植株生长环境、花粉发育阶段、离体胚挽救时间、胚发育时期、染色体加倍、倍性鉴定和植株再生技术等，为该技术的开展和应用提供可行的理论依据。

1 基因型

基因型是影响辐射花粉授粉和离体胚挽救的关键因素之一。Lofti[7]和裴晓利等[8]研究表明，不同黄瓜基因型辐射花粉诱导单倍体产率有差异。雷春等[9]进一步研究发现不同基因型花粉授粉要比同一基因型花粉授粉诱导的单倍体产率高。当黄瓜母本为‘JL4’、父本为‘CC3（200）’和‘JL4（200）’时，坐果率分别50%和12.5%，并且只有以‘CC3（200）’为父本时才有单倍体产生，表现出一定的父本基因型差异；当父本均为‘Y2A（300）’，母本分别为‘SL4’和‘Y2A’时，坐果率分别为37.5%和62.5%，单倍体产率（单倍体数/胚培养种子数）分别约为1.1%和0.4%，表现出一定的母本基因型差异。谢淼等[10]研究认为，黄瓜基因型对植株再生率及单倍体再生率均有影响。而Caglar等[11]研究表明，黄瓜27种基因型对单倍体的诱导率没有很大差别，每个果实中获得的单倍体胚均约为3.8个，每个果实中获得的单倍体植株数均约为1.1个；Faris等[12]试验了8种黄瓜基因型，进一步证明同一剂量下的单倍体发生率同黄瓜基因型无关。

此外，Sestili等[13]研究表明不同的甜瓜正反交组合对单倍体诱导率的影响差异显著。张永兵等[14]研究表明，甜瓜母本基因型对坐果和单倍体胚的形成都有一定的影响。

2 辐射剂量

常用的辐射源有放射性元素（35P，32S），离子束（X和γ射线）和非离子束（UV）。Faris等[12]认为60Co-γ射线是诱导单倍体的有效辐射源。

确定适宜的辐射剂量是诱导雌核发育单倍体成败的关键，实践中大多以临界剂量或半致死剂量作为适宜剂量的标准。花粉管的生长与辐射剂量有显著的相关性（R=0.97）[15]。辐射剂量同植物的倍性及花粉粒大小有关，倍性越高，花粉粒越小，越耐辐射[16]。西葫芦上推荐剂量为25～50 Gy[4]；黄瓜和西瓜常用的推荐剂量为 200～300 Gy[3，17]；甜瓜上推荐剂量为 500～2 500 Gy[1，15]。

也有一些学者用X射线辐射花粉的报道，如Yashiro等[18]利用 X 射线（67.08 C·kg-1）辐射花粉，在5 个甜瓜基因型‘Earl＇s red’‘Carol’‘Quincy’‘Rupia red’和‘View red’上单倍体胚的诱导率分别为0.16%、0.03%、0.03%、0.13%和0.17%；查丁石[19]利用软X射线以650 Gy的总辐射剂量照射获得了甜瓜单倍体植株。

3 辐射剂量率

单倍体诱导频率还受辐射剂量率的影响。Deunff等[20]研究发现高剂量会使黄瓜花粉管生长减慢，但是在授粉6 d之后，2种不同剂量率照射下的花粉管都已到达胚囊。许利彩等[21]研究表明，辐射剂量率对西葫芦胚的诱导率、植株再生率及植株成活率均影响极显著。辐射剂量率为45.19 Gy·min-1时获得的不饱满种子或不同形态胚的数量最多，为61个，植株再生率和植株成活率也最高，分别是91.80%和49.18%，与其他2个处理差异极显著；25 Gy·min-1时获得的不饱满种子或不同胚状体数量次多，为56个；而5 Gy·min-1最低，仅为26个，植株再生率和植株成活率也最低，分别是76.92%和26.92%。而 Cunny 等[15]研究表明，18 Gy·min-1和79 Gy·min-1（总剂量为500～3 600 Gy）对甜瓜花粉萌发率和活力没有影响。

4 生长环境

环境因子对单倍体诱导率同样有重要影响，适宜的温度和湿度下单倍体发生率较高。6—9月甜瓜单倍体发生率[22]较高，秋季单倍体诱导率相对较低[15]。黄瓜也是在气温高的6—9月（地中海海洋性气候）可得到较高单倍体发生率[17]。

5 花粉发育阶段

花药、花序、花芽及整朵花都可以进行辐射处理，通常用开花前1 d的雄花进行辐射处理，次日给母株授粉。Yanmaz等[23]研究表明，辐射剂量为350 Gy的黄瓜花粉活力最高，但花粉活力丧失最快，120 h之后花粉活力为0，最终得到0株单倍体。所以，尽量选用开花当天的花粉立即辐射授粉，否则单倍体诱导率会大大降低；且每朵雌花需用3～4朵经射线处理的雄花授粉，增加花粉管到达胚囊的数量，有效的促进雌核发育[1，24]。开放当天和开放前1 d的黄瓜雄花经过不同剂量辐射后授粉，对坐果率影响不大，但是单倍体胚产率以辐射开放前1 d雄花授粉效果更好[25]。

6 离体胚挽救

由于辐射花粉诱导雌核发育过程中败育胚的比例相当高，所以常利用离体胚挽救技术提高诱导率。

Sauton等[1]发现，甜瓜幼胚在 MS+0.2 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培养基上进行胚抢救更容易发育成胚状体。孙玉宏等[26]在甜瓜离体胚挽救试验中也得到相同结论，同时研究表明，辐射授粉后12 d左右的甜瓜果实中的可抢救的胚的数量较高。Custer等[27]研究发现，幼胚发育到心形胚阶段在适宜的培养基（E20A培养基含0.01 mg·L-1IAA）上进行胚珠离体挽救，可以提高单倍体胚的诱导率。Kurtar等[4]在西葫芦离体培养中发现球形胚、箭状胚和杆状胚可以发育形成单倍体，仅有53.8%鱼雷形胚和23.1%的心形胚发育成单倍体，其余的鱼雷形胚、心形胚及子叶形胚及畸形胚则发育成双单倍体。Sari等[3]研究表明，西瓜离体胚挽救的最佳时间为辐射授粉后3～4周，即多数胚为心形胚时单倍体诱导率高。裴晓利等[8]研究表明，黄瓜适宜的离体胚挽救时期也为授粉后3～4周，此时单倍体胚诱导率较高，且单倍体再生植株生长发育正常。

7 倍性鉴定与植株再生

7.1 染色体加倍

秋水仙素（秋水仙碱）是染色体加倍的常用试剂，Sari等[28]用质量分数0.5%和1.0%秋水仙素处理西瓜单倍体植株 1、2、4、6 h，结果表明 0.5%秋水仙素处理4 h或1.0%秋水仙素处理2 h均可获得二倍体植株。

7.2 倍性鉴定

瓜类二倍体植株与单倍体、三倍体、四倍体在形态上有比较明显的差别[29]。主要表现在子叶、真叶的形状和颜色，花的形状和颜色，果实形状以及种子的形态，这些形态差异是从外观上用目测法鉴别瓜类多倍体的较为可靠的指标。Sari等[30]研究比较了2个西瓜品种二倍体及其单倍体植株的田间表现，发现单倍体植株的叶面积、茎长度、茎粗度显著低于二倍体，单倍体植株的雌、雄花也明显小于二倍体，单倍体雄花中没有花粉粒，而二倍体则有。

Sari等[30]研究表明，单倍体西瓜植株的气孔长度、直径和保卫细胞中叶绿体的数目分别为17～18、10～12 μm 和 6～7 个，而二倍体约为 23～24、18 μm和11～12个。根据保卫细胞的大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的数目，可以有效区分倍性。

流式细胞测定法采用扫描细胞光度仪（也叫倍性分析仪）迅速测定叶片单个细胞核内DNA含量，根据DNA含量的曲线图推断细胞的倍性。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小和很嫩时，仅用l cm2的样品就能鉴定出材料倍性[28，31]。

7.3 植株再生

查丁石[19]将萌发的12个甜瓜幼胚移植到MS+20.0 mg·L-1葡萄糖+3.0 mg·L-1琼脂固体培养基上培养，获得4株单倍体植株幼苗。单倍体植株通过茎节切段进行增殖培养，10周后获得54株生根再生植株。张永兵等[14]研究表明，甜瓜单倍体幼苗的顶芽或腋芽分化增殖最适培养基为MS+0.5 mg·L-16-BA，生根最佳培养基为1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。

8 问题与展望

利用花粉辐射和离体胚挽救技术获得瓜类单倍体植株是一个较为成功的途径，众多国内外学者研究了一些影响因素，如基因型、辐射剂量、辐射剂量率、植株生长环境、花粉发育阶段、离体胚挽救时间、胚发育时期、染色体加倍、倍性鉴定和植株再生技术等，并取得了一些重要进展，如亲本基因型和辐射剂量是决定花粉辐射技术的关键因素；不同作物的适宜辐射剂量有差异，因此，选择合适的基因型和适宜的辐射剂量是诱导单倍体胚成败的关键。植株生长环境和花粉发育阶段对单倍体诱导率同样有重要影响，6—9月单倍体诱导率高于秋季；开放当天和开放前1 d的雄花辐射授粉较好。辐射剂量率也极显著影响单倍体诱导率，如用辐射剂量率为45.19 Gy·min-1处理西葫芦时获得的不饱满种子或不同形态胚的数量最多，为61个；植株再生率和植株成活率也最高，分别是91.80%和49.18%。

采用离体胚挽救技术是因为辐射花粉诱导雌核发育过程中败育胚比例高，所以通过离体培养技术将幼胚转移到培养基上促进进一步发育，从而提高单倍体胚诱导率。因此，适宜的胚挽救时间和幼胚发育时期是离体胚挽救技术成败的关键，胚挽救抢救时间因作物种类而异，但幼胚发育适期是心形胚和子叶形胚。

常用的加倍试剂是秋水仙素，一般浓度以0.5%～1.0%为宜。常用的倍性鉴定方法有：形态鉴别法、气孔保卫细胞叶绿体数目鉴定法和流式细胞测定法等，可根据自身实验室建设条件选择应用。常用瓜类作物单倍体植株顶芽或腋芽分化增殖培养来建立植株再生体系。

利用花粉辐射和离体胚挽救技术已在黄瓜、西瓜、甜瓜、西葫芦、南瓜、冬瓜等多种瓜类作物上获得了单倍体植株。但目前辐射花粉诱导技术机制还不完全清楚，一种观点是双核花粉被射线照射时，生殖核尚未有丝分裂，受照射损伤生活力丧失，而此时如果营养核仍然有机能时，花粉仍能萌发，花粉管也能在花柱上生长，但因生殖核已无生活力，故只能刺激卵细胞分裂发育，而不能起到受精的作用；另一种观点是双核花粉被射线照射时，生殖核染色体异常分裂，造成2个精核之间染色体的不均衡分配，但是生活力并未丧失，仍可与卵细胞或者其他单倍体细胞结合，但是由于染色体的数目异常，不能与卵细胞或者其他单倍体细胞配对，导致无法正常受精，却刺激了卵细胞或者其他单倍体细胞分裂产生单倍体。目前国内外学者仅对胚挽救的时间、幼胚发育时期进行了研究，对于影响离体胚挽救技术的其他因素如培养基、激素、温度、活性炭、培养方式等有待于进一步深入研究，以提高单倍体胚诱导率。