白念珠菌FLO8基因突变株构建及鉴定

李文静刘明刘锦燕史册王影赵悦项明洁(.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海0005;.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海0000)



白念珠菌FLO8基因突变株构建及鉴定

李文静1,2刘明1刘锦燕2史册1王影1,2赵悦1,2项明洁1,2
(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海200025;2.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放免检验科,上海200020)

【摘要】目的 构建白念珠菌FLO8基因突变株。方法 将白念珠菌FLO8基因插入pCP20质粒载体ADH1启动子之后,通过定向诱变获得FLO8基因R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变质粒载体,再通过同源重组技术将带有FLO8突变的基因片段整合至SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结果 通过测序鉴定FLO8基因突变质粒载体构建成功;通过PCR验证表明突变FLO8基因整合到SN152flo8/flo8菌株的ADE2位点。结论 以pCP20质粒为载体,通过定向诱变、同源重组等技术,可以高效构建白念珠菌FLO8基因突变株。

【关键词】白念珠菌;FLO8基因;突变株

[Chin J Mycol,2016,11(1):1-7]

双相真菌白念珠菌是人类最常见的机会性致病菌,主要感染食管、口咽等黏膜,在免疫功能低下或有基础疾病的患者(如艾滋病、糖尿病、恶性肿瘤、造血干细胞或固体器官接受者、放疗或化疗患者)很容易引起系统性念珠菌病[1-2]。在过去的20 ～30 a中,念珠菌感染越来越普遍和严重,这也成为日益严重的公共卫生问题[3-4]。

白念珠菌能够在多种形态之间转换,而且菌丝生长及形态转换的能力对其黏附、增殖、致病性、毒力都有着重要影响[5]。白念珠菌菌丝生长及形态转换受环境因素和信号转导通路的影响[6],其中, MAPK通路和c AMP/PKA通路是最重要的[7]。转录因子FLO8含有Lis H结构域,是c AMP/ PKA通路的下游调节因子,通过影响白念珠菌形态转换从而影响其致病性和毒力[8]。

我们从患有复发性外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)的成年女性那里分离得到4个白念珠菌临床菌株,观察它们的形态特征,发现其中2株的菌丝更长,黏附于聚苯乙烯表面和侵入琼脂糖培养基的能力也更强。然后,对这4个临床菌株的FLO8基因全长进行测序,发现5个突变(R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D);我们推测,FLO8突变可能与白念珠菌表型和致病力有关,因此,参照Wang等[9]方法,构建白念珠菌FLO8突变株,以备进一步研究。

1 材 料

1.1 菌株和质粒

本研究使用的白念珠菌FLO8基因敲除株SN152flo8/flo8是按照Nobel等[10]方法由SN152菌株构建而来(SN152亲本菌为SC5314), SN152菌株和质粒pCP20(如图1)均由第二军医大学新药研究中心实验室馈赠;大肠杆菌E.coli DH5α由本实验室保存;DMT点突变感受态细胞购自北京华越洋生物科技有限公司。本研究构建或使用的菌株和质粒见表1。

1.2 培养基

表1 菌株和质粒Tab.1 Strains and plasmids

按1%酵母提取物(YEAST EXTRACT,英国Oxoid公司)+2%蛋白胨(TRYPTONE,同上) +2%葡萄糖(美国Sigma-Aldrich公司)配制YPD液体培养基;YPD固体培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基)购自上海博微生物科技有限公司;0.5%酵母提取物(同上)+1%蛋白胨(TRYPTONE,同上)+1%NaCl,用Na OH调节p H至7.0,高压灭菌后加入0.1%氨苄青霉素(碧云天)配制含氨苄青霉素LB液体培养基;含氨苄青霉素LB液体培养基+3%琼脂糖(上海博微生物科技有限公司)配制含氨苄青霉素LB固体培养基;酵母选择营养缺陷固体培养基SD-Arg4(SD合成培养基中缺少精氨酸)购自北京泛基诺科技有限公司。

1.3 主要试剂、仪器

Ex Taq酶(TaKaRa公司);KOD-Plus酶(TOYOBO公司);SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(生工生物工程有限公司);QuikChange Site-directed Mutagenesis kit(QuikChange定点突变试剂盒)购自安捷伦科技有限公司;一步法定向克隆无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司); 1 kb DNA marker(天根);DL5000、DL1000 DNA Marker(TaKaRa公司);Goldview新型核酸染料(赛百威公司);PCR产物回收试剂盒(Biomiga公司);酵母高效转染试剂盒(北京泛基诺公司); TanonEPS-300水平式电泳仪和Tanon凝胶成像系统(上海天能科技有限公司);PCR仪(S100TM Thermal Cycler PCR,Bio-Rad美国)。

1.4 引物

白念珠菌FLO8基因ORF全长为2 379 bp,根据白念珠菌基因组数据库中的基因序列设计FLO8基因编码区上下游引物,在引物5'端加上黏性末端设计成FLO8-F/R;根据pCP20质粒DNA序列设计引物,在引物5'端加上黏性末端设计成p CP20-F/R;根据p CP20质粒基因序列设计合成引物VP18、VP26、CAP22、CAP23;根据SN152和p CP20质粒基因序列设计验证引物VP28、VP29、VP30、VP31。引物设计运用软件Primer Premier 5,并由生工生物工程(上海)有限公司进行合成。引物序列见表2。

表2 实验中所用引物Tab.2 Primers used in this study

2 方 法

2.1 菌株保存与培养

所有白念珠菌菌株保存在-80℃YPD液体培养基中(含有25%甘油),待用时接种在YPD固体培养基上,37℃过夜培养。挑选Arg4阳性转染子时,转染子在SD-Arg4培养基上30℃培养2 d。大肠杆菌E.coli DH5α和DMT感受态细胞保存在-80℃LB液体培养基中(含有25%甘油),待用时接种在LB固体培养基上,37℃过夜培养。

2.2 质粒转化与抽提

参照王影等[11]氯化钙质粒转化法,取大约5 μL质粒反应液,加入到50μL已制备好的感受态大肠埃希菌DH5α内,轻弹管壁数下混匀,置冰上30 min,后置42℃热激90 s,立即于冰水浴中孵育2 min。加入1 m L LB培养液37℃摇菌1 h,后用无菌玻璃棒将菌液均匀涂布于含氨苄青霉素的LB选择性平板上过夜孵育。用接种环挑取平板上单克隆菌落并接种于含有氨苄青霉素的LB培养液中,过夜培养(200 r/min,37℃),参照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒说明书抽提质粒。

2.3 FLO8基因突变质粒载体构建

白念珠菌FLO8基因片段和p CP20线性化克隆载体制备 为了让白念珠菌FLO8基因(全长2 379 bp)能够在pCP20的ADH1启动子后面表达,首先以SN152为模板,FLO8-F和FLO8-R为引物扩增白念珠菌FLO8基因全长,反应体系(50μL) 为:1μL KOD-Plus-Neo酶、5μL 10×PCR buffer、5μL d NTPs、2μL MgSO4、引物各1μL、模板200 ng。PCR反应条件为:94℃2 min预变性; 94℃15 s,53℃50 s,68℃2 min,共20个循环, 68℃15 min延伸。以p CP20为模板,p CP20-F和p CP20-R为引物扩增p CP20片段,反应体系同上,反应条件除了68℃延伸为8 min外同上。PCR产物经凝胶电泳回收备用,同时FLO8片段送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

FLO8基因和pCP20质粒片段连接及定向诱变取1.5 m L高压灭菌后的EP管于冰水浴中,按照一步法定向克隆无缝克隆试剂盒配置如下反应体系(20μL):4μL 5×CEⅡBuffer、FLO8基因片段100 ng、pCP20线性化克隆载体160 ng、2μL ExnaseTMⅡ、dd H2O,用移液器轻轻吹打混匀,置37℃水浴30 min,后立即置于冰水浴中冷却5 min,以此构建pCP21质粒。按上述方法转化并抽提。

根据想要构建的突变株突变位点来设计引物对R209T-F/R、A311T-F/R、654Ter-F/R、G723RF/R、T751D-F/R,按照Quik Change标准点突变试剂盒说明书配置如下反应体系(50μL):5μL 10 ×Buffer、50 ng抽提的pCP21质粒DNA、125 ng正反向引物、1μL d NTP mix、1μL Pfu Turbo DNA聚合酶、dd H2O,PCR反应条件为:95℃30 s预变性;95℃30 s,55℃1 min,68℃10 min,共12个循环。生成相应带有FLO8突变的质粒载体p TB22、p TB23、p TB24、p TB25、p TB26。反应完成后各反应液放置在冰上冷却2 min。

向如上各反应体系加入1μL DpnⅠ限制性内切酶,移液枪轻轻吹打混匀,低速离心1 min后立即37℃孵育2 h以将p CP21质粒DNA彻底去除干净。同样按上述方法转化、挑选阳性转染子、扩增、抽提。以VP18和VP26为引物将p TB22、p TB23、p TB24、p TB25、p TB26各个质粒载体上带有突变的FLO8基因扩增出来,扩增产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

2.4 FLO8基因突变株构建

为了使突变的FLO8基因在FLO8敲除株中表达,以抽提的p TB22、p TB23、p TB24、p TB25、 p TB26各个质粒载体DNA为模板,CAP22/23为引物,PCR扩增带有R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变FLO8基因、ADH1启动子和筛选标记Arg4的DNA片段,即ADH1-FLO8R209 T/A311 T/654Ter/G723R/T751D-Lox P-ARG4-Lox PADE2片段,反应体系及反应条件除了68℃延伸为10 min外同扩增FLO8基因全长。取少量PCR反应液电泳,其余PCR产物乙醇沉淀回收。采用高效醋酸锂转染法将回收的各DNA片段转染至SN152flo8/flo8菌株上ADE2位点,在SD-Arg4酵母选择营养缺陷固体培养基上筛选阳性转染子,以此构建FLO8突变株TB22、TB23、TB24、TB25、TB26。挑选阳性转染子,扩增、抽提DNA,以抽提的DNA为模板,VP28/29、VP30/31为引物进行PCR反应,以鉴定DNA片段是否同源重组至ADE2位点。同时,再一次以VP18/26为引物将各突变株上带有突变的FLO8基因扩增出来,扩增产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

3 结 果

3.1 FLO8基因突变质粒载体构建

白念珠菌FLO8基因片段和p CP20线性化克隆载体制备 以SN152为模板,FLO8-F/R为引物扩增白念珠菌FLO8基因全长,扩增产物片段大小为2 456 bp,电泳结果如图2泳道1～3所示。将回收的FLO8基因片段产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序,测序结果与白念珠菌野生型SC5314的FLO8基因序列对比,第3次扩增产物FLO8基因没有点突变。以pCP20为模板, pCP20-F/R为引物扩增pCP20线性化克隆载体,扩增产物片段大小为8 742 bp,电泳结果如图3泳道1所示。

FLO8基因和p CP20线性化克隆载体连接及定向诱变以VP18/26为引物,将p TB22、p TB23、p TB24、p TB25、p TB26各个质粒载体上带有突变的FLO8基因片段扩增出来,将回收的产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序,测序结果与SC5314的FLO8基因序列相比,除了相对应的R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变外,其余碱基均无突变,FLO8基因突变p CP20质粒载体构建成功。

3.2 FLO8基因突变株构建

以抽提的各质粒载体DNA为模板,CAP22/23为引物,PCR扩增带有R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变FLO8基因、ADH1启动子和筛选标记Arg4的DNA片段,即ADH1-FLO8R209 T/A311T/654 Ter/G723R/T751D-Lox P-ARG4-Lox PADE2片段,扩增产物片段大小为9 120 bp,图3泳道2所示为ADH1-FLO8R209 T-Lox P-ARG4-Lox P-ADE2片段。挑选阳性转染子,以VP28/29、VP30/31为引物进行PCR反应,以鉴定DNA片段是否同源重组至ADE2位点,该反应为套式PCR,引物VP28和VP31分别位于CAP22的上游和CAP23的下游,即同源重组ADE2位点5'端的上游和3'端的下游,而引物VP29和VP30分别位于同源重组片段的上游和下游。VP28/29、VP30/ 31扩增产物片段大小分别为517 bp、613 bp,各种突变株均挑选8个转染子,经鉴定阳性菌株均为7个或8个,如图4所示为8个TB22转染子电泳结果,1～8为上游片段,9～16为下游片段,阳性菌株有7个。同样,以VP18/26为引物扩增各突变株上带有突变的FLO8基因,扩增产物送至生工生物工程(上海)有限公司测序,测序结果除了相对应的R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变外,其余碱基均无突变,FLO8突变株TB22、TB23、TB24、TB25、TB26构建成功。

图1 pCP20质粒:全长8 758 bp,含有ADH1启动子、筛选标记Arg4和两段白念珠菌SN152的ADE2同源序列,其中ADE2同源序列3'端534 bp,5'端400 bp 图2 以FLO8-F/R为引物PCR扩增白念珠菌SN152得到FLO8基因电泳结果 图3 pCP20线性化克隆载体和ADH1-FLO8R209T-LoxP-ARG4-LoxP-ADE2片段电泳结果 图4 8个TB22突变转染子的同源重组片段的上游和下游PCR鉴定结果Fig.1 Plasmid pCP20 used in this study Fig.2 The electrophoresis results of FLO8 amplified by PCR,using Candida albicans SN152 as template and FLO8-F/Ras primers Fig.3 The electrophoresis results of the linear pCP20 cloning vector and the ADH1-FLO8R209T-LoxP-ARG4-LoxP-ADE2 fragment Fig.4 Identification of the upstream and downstream of eight TB22 mutations'homologous recombinant fragments

4 讨 论

目前,随着分子生物学技术不断发展,研究特定基因功能的方法如基因的敲除、回复、高表达、突变株的构建等技术日渐成熟,为进一步研究基因功能提供了良好的技术基础[12-13]。构建基因突变株研究过程中,载体的选择、载体的构建、基因的高保真性、定向诱变后原始模版的消化都很重要。

本研究使用pCP20质粒作为载体,该载体是专门构建用于白念珠菌SN152基因功能研究的,含有ADH1启动子、筛选标记Arg4和ADE2位点,将目的基因FLO8连接在pCP20质粒的ADH1启动子之后,然后通过定向诱变,使FLO8产生相应的点突变,再通过PCR将构建的质粒上的带有ADH1启动子、突变FLO8基因、Lox PARG4-Lox P、ADE2位点的片段扩增下来,转染白念珠菌SN152flo8/flo8菌株,pCP20质粒上带有两段ADE2片段,3'端534 bp,5'端400 bp,分别与SN152上的ADE2基因两端同源,通过同源重组技术使ADH1-FLO8R209 T/A311T/654Ter/G723R/T751D-LoxPARG4-Lox P-ADE2基因片段整合至SN152flo8/ flo8菌株的ADE2位点,以此来构建FLO8基因突变株。

在构建FLO8基因突变质粒载体时,本研究没有采用目前广泛应用的酶切连接法。酶切连接法是用含酶切位点的引物扩增目的基因,用酶来酶切该基因和质粒载体,然后用连接酶将目的基因与质粒载体连接起来。本研究采用同源重组方法,扩增FLO8基因和pCP20线性化克隆载体时使用5'端含黏性末端的引物,在重组酶ExnaseTMⅡ的作用下,FLO8基因的5'端和3'端分别与pCP20线性化克隆载体的3'端和5'端连接,这种同源重组法操作简单、周期短[14]。而酶切连接法过程繁琐:对引物设计要求严格、目的基因需要进行T-A克隆、酶切效率低、连接效率低、操作要求高、实验条件不易掌握[14-15]。

基因突变株的构建对目的基因的准确性要求也很高,本研究目的是构建相应的FLO8突变株,所以在定向诱变之前,FLO8基因模板不能出现突变,或不能出现导致氨基酸改变的突变,在扩增FLO8基因时就要求有很高的保真性,本研究第1次使用Pfu Ultra II Fusion HS DNA高保真聚合酶(安捷伦科技有限公司)扩增产物送测序有4个点突变,第2次使用KOD-Plus高保真聚合酶(TOYOBO公司),按照说明书50μL反应体系加2.5μL MgSO4,扩增产物凝胶电泳时出现较明显拖尾现象,且送测序有2个点突变,之后将MgSO4浓度由2.5μL调整为2μL,扩增产物凝胶电泳时拖尾现象不明显,扩增产物送测序也没有点突变。同样,最后构建的突变株FLO8基因除有需要的点突变外,其余碱基不能出现突变,本研究用KODPlus高保真聚合酶对TB22、TB23、TB24、TB25、TB26突变株进行验证,测序结果除了相对应的R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变外,其余碱基均无突变。

同样,FLO8基因和p CP20线性化克隆载体连接及定向诱变之后对于原始模板,即没有点突变的pCP20质粒DNA的清除也很重要,本研究使用DpnⅠ限制性内切酶对其进行消化处理,说明书建议37℃孵育1 h,本研究将孵育时间延长至2 h以将原始模板彻底处理干净,因为如果有很少量的原始模板残留,在转染之后,营养缺陷板上也会长出很多假阳性转染子,从中筛选真阳性转染子将显著降低效率,并且过程繁琐。

而转录因子FLO8在白念珠菌酵母、假菌丝及菌丝多种形态之间转换扮演何种角色,在c AMP/ PKA通路中又是如何调节信号转导的,对研究白念珠菌毒力、致病性有着重要作用,本研究成功构建白念珠菌FLO8 R209T、A311T、654Ter、G723R、T751D突变株,将为下一步研究提供基础。

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[本文编辑]王 飞

·消息·

Construction and identification of Candida albicans FLO8 mutations

LI Wen-jing1,2,LIU Ming1,LIU Jin-yan2,SHI Ce1,WANG Ying1,2,ZHAO Yue1,2,XIANG Ming-jie1,2
(1.Department of Clinical Laboratory,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200025,China;2.Radioimmunology and Clinical Laboratory,Luwan Branch,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200020,China)

【Abstract】Objective To construct Candida albicans FLO8 mutations.Methods We inserted Candida albicans FLO8 gene under the control of the ADH1 promoter in pCP20 plasmid,and plasmids containing the point mutations FLO8R209T, FLO8A311 T,FLO8654Ter,FLO8G723Rand FLO8T751Dwere constructed using site-directed mutagenesis from plasmid pCP20.Then we introduced the inserts with FLO8 point mutations into Candida albicans SN152 flo8/flo8 at the endogenous ADE2 gene loci by homologous recombination.Results The plasmids with FLO8 point mutations were constructed successfully by DNA sequencing;The inserts with FLO8 point mutations were exactly recombined to the ADE2 gene loci of Candida albicans SN152 flo8/flo8 as confirmed by PCR.Conclusions Candida albicans FLO8 mutations can be efficiently constructed with pCP20 plasmid by site-directed mutagenesis,homologous recombination,etc.

【Key words】Candida albicans;FLO8;mutations

[收稿日期]2015-10-21

通讯作者:项明洁,E-mail:mjxiang123456@126.com

作者简介:李文静,女(汉族),硕士研究生在读.E-mail: 15000028775@163.com;刘明,女(汉族),本科,主管技师.E-mail: mingliu1962@hotmail.com

基金项目:上海市科委基金(15ZR1426900);上海市医学重点专科(ZK2012A21);上海市黄浦区优秀青年人才(RCPY1407)

【中图分类号】R 379.4

【文献标识码】A

【文章编号】1673-3827(2016)11-0001-07