羧甲基壳聚糖预防兔手术后粘连的效果:大体和病理学大样本观察

任常，赵大春，朱兰

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1妇产科2病理科，北京100730

羧甲基壳聚糖预防兔手术后粘连的效果:大体和病理学大样本观察

任常1，赵大春2，朱兰1

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1妇产科2病理科，北京100730

目的评价羧甲基壳聚糖(N，O-carboxymethyl chitosan，NOCC)预防兔手术后粘连的效果。方法220只雌性大耳白兔采用双子宫模型造成手术粘连，随机分组后接受单纯造模手术(对照组)或造模手术+关腹前腹腔内注射NOCC(NOCC组)。所有手术均由同一位术者完成。每组各22只大耳白兔在实验设计的5个观察时间点(术后3、7、14、28和42 d)分别被处死并评估其粘连情况，包括范围、类型和强度等大体情况和炎症、纤维化以及新生血管等镜下情况。结果NOCC组在术后3 d时其粘连的范围(P=0.0337)和强度(P=0.0271)以及炎症反应情况(P＜0.0001)均显著轻于对照组。在术后14 d内，NOCC组的纤维化情况均明显轻于对照组(P均＜0.0005)。与对照组相比，NOCC组的粘连强度在术后14、28、42 d均明显减轻(P均＜0.05)，而其粘连类型评分在术后28和42 d也明显降低(P均＜0.05)。结论经NOCC处理后，兔盆腹腔术后粘连大体和病理学评分均不同程度降低。应用NOCC可有效预防盆腹腔术后粘连。

羧甲基壳聚糖;术后粘连;兔双子宫模型;随机对照研究

Med J PUMCH，2016，7(5):347－352

盆腹腔粘连常继发于各种手术操作，其发生率高达94%［1-2］。粘连是术后肠梗阻、腹痛、不孕等的主要原因，不但给患者带来痛苦，也增加了家庭和社会的经济负担［3］。提高手术技巧并不一定能减少术后粘连及相关并发症的发生。Ten Broek等［4］分析了27项关于改善手术操作和粘连相关预后的研究，发现没有任何一种操作能显著降低术后小肠梗阻的发生率。因此需要借助其他防粘连措施来减少术后粘连形成，如抗氧化剂、抗炎药物、促纤溶药物，以及局部应用液态或者隔膜类材料［5-8］。壳聚糖因具有止血、抗病原微生物和抑制肿瘤生长因子-β的特性而被用于预防术后粘连［9-11］。羧甲基壳聚糖(N，O-carboxymethyl chitosan，NOCC)通过在壳聚糖内核上添加羧甲基，形成一种水溶性、带负电荷、生物相容的聚合物。NOCC已被证实具有降低术后粘连形成的作用，其作用可能通过阻断炎症细胞粘附以及物理屏障实现［12］。但现有研究多从大体角度研究其防粘连效果，且样本量有限。本研究旨在通过大样本随机对照实验探讨应用NOCC对于兔双子宫模型术后粘连的大体和镜下评分的影响。

材料和方法

研究动物和材料

健康性成熟非孕雌性日本大耳白兔220只，体重2.16～2.80 kg，由中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所提供，符合国家医用实验动物标准。本实验通过北京协和医院实验动物伦理委员会批准。

3-0薇乔可吸收缝线(强生公司，美国)、1-0慕斯丝线(强生公司，美国)、2%羧甲基壳聚糖(医用几丁糖，1 ml规格，上海其胜生物制剂有限公司，中国)。

实验设计

220只大耳白兔首先按照电脑随机数字法被随机分配接受单纯造模手术(对照组，n=110)或者造模手术+关腹前腹腔内注射NOCC(NOCC组，n= 110)，每组再进一步通过电脑随机数字法随机分配入5个观察时间点(术后3、7、14、28、42 d)亚组(n=22)。所有实验动物均按照双子宫手术模型由同一位术者进行手术操作，并根据分组于预定日期处死进行大体和镜下观察［13-14］。

粘连评价

由同一位检查者结合妇科手术系统和美国生育学会(American Fertility Society，AFS)的粘连评分标准采用盲法对所有实验动物粘连的范围、类型和强度进行大体评分，取粘连最重部位的评分进行计算［14-15］。由两位病理医生采用盲法同时对镜下所见粘连的急慢性炎症、纤维化以及新生血管形成情况进行评分后取平均值［16-17］。

统计学处理

采用SAS 9.1进行数据录入和分析。符合正态分布的数据采用均数±标准差进行描述，应用t检验进行统计分析。不符合正态分布的数据采用中位数和四分位数进行描述，应用非参数方法比较两组间差异。双侧检验P＜0.05认为差异有统计学意义。

结果

一般情况

NOCC组和对照组大耳白兔的平均月龄分别为(5.30±0.23)个月和(5.43±0.31)个月，体重分别为(2.43±0.31)kg和(2.53±0.33)kg，两组间具有可比性(P＞0.05)。

粘连评价

大体观察:术后3 d时，粘连多局限在子宫和膀胱之间，粘连疏松、呈膜状，没有血管形成(图1A)。NOCC组创面没有明显NOCC残留，粘连较对照组更疏松，其粘连的范围和强度评分显著低于对照组(P=0.0337，P=0.0271)。术后7 d时，粘连范围和强度均增加，但仍然易于分离(图1B)。NOCC组的粘连较对照组更疏松。术后14 d时，粘连的范围和强度与术后7 d相似，新生血管不明显。NOCC组粘连仍较对照组疏松，其粘连强度评分明显低于对照组(P=0.0410)。术后28 d时，粘连范围增加，新生血管网开始形成(图1C)。NOCC组的粘连范围与对照组相比较局限，新生血管不明显，其粘连的类型和强度评分均显著低于对照组(P=0.0210，P＜0.0001)。术后42 d，与术后28 d相比，粘连的范围和强度均减轻(图1D)。在NOCC组，粘连的范围、强度和类型评分均较术后28 d时降低;同时，NOCC组的粘连比对照组更疏松、新生血管更细更少(图1E)，其粘连的类型和强度评分均显著低于对照组(P=0.0027，P=0.0002)(表1)。

表1 NOCC组和对照组在术后5个时间点的大体粘连评价情况

图1 大耳白兔双子宫造模手术后盆腹腔粘连的大体观察因两组变化趋势相似，故A～D均展示对照组大体所见;A.术后3 d对照组:子宫和膀胱间的疏松、膜状粘连;B.术后7 d对照组:可见1例新生血管(箭头);C.术后28 d对照组:新生血管网形成(箭头);D.术后42 d对照组:粘连范围较28 d降低;E.术后42 d NOCC组:粘连更疏松，新生血管更细NOCC:羧甲基壳聚糖

镜下观察:术后3 d时，炎症细胞浸润很明显，组织水肿，有成纤维细胞或肌纤维母细胞漂浮(图2A)。NOCC组的微脓肿更少，其炎症反应和纤维化程度均显著轻于对照组(P＜0.0001，P=0.0004)。术后7 d时，急性炎症渗出逐渐为慢性炎症所取代。在部分标本中，肉芽组织周围可见由几个或甚至单个内皮细胞构成的新生微毛细管(图2B)。NOCC组的类蛋白渗出较常见，而纤维化不明显，其评分与对照组的差异有统计学意义(P＜0.0001)。术后14 d时，急性炎症细胞变得稀疏，炎症逐渐消退，而纤维增生增加;浆膜表面的纤维化主要由胶原和一些平滑肌样细胞组成。NOCC组的胶原相对疏松，其粘连的纤维化程度明显轻于对照组(P=0.0002)。术后28 d时，纤维化逐渐变得致密，新生血管开始形成血管网。很多小血管已具有小动脉的完整结构，部分直径已超过100 μm(图2C)。NOCC组的新生血管直径与对照组相似。术后42 d时，浆膜表面的纤维组织范围和纤维增生的厚度降低，但密度增加(图2D)。新生血管的数量和形态与术后28 d相似(图2E)(表2)。

图2 大耳白兔双子宫造模手术后盆腹腔粘连的病理表现(HE染色，×150)A.术后3 d对照组:可见微脓肿(箭头);B.术后7 d对照组:可见新生微毛细管(箭头);C.术后28 d对照组:可见一条有完整结构的大毛细血管，在其下方可见慢性炎症细胞浸润(箭头);D.术后42 d对照组:纤维密度增加;E.术后42 d NOCC组:新生血管与术后28 d相似NOCC:同图1

表2 NOCC组和对照组在术后5个时间点的镜下粘连评价情况

讨论

很多研究已探讨NOCC预防粘连的效果和机制，但很少有研究结合大体和镜下所见［18］。为更好地了解其防粘连的作用，笔者研究了两种条件下观察到的粘连变化情况。

之前有大鼠实验发现NOCC能显著降低术后腹腔粘连的发生率和粘连强度［19-20］。在本实验中，术后3 d NOCC组的炎症评分显著低于对照组。证据显示炎症反应，包括成纤维细胞的激活及其在组织损伤部位的聚集，对于粘连形成过程的启动至关重要［21］。术后16～36 h是创面粘连形成最敏感的时期［22-23］。在这个关键阶段，NOCC可以起到物理隔膜的作用，将受损的浆膜分离开，使炎症反应局限的同时也能稀释炎性渗出物，从而减少局部炎症细胞和细胞因子，进而缓解炎症反应［24］，因此减轻了大体观察所见粘连的范围和强度。

术后1周粘连的范围和强度均增加，这与Li等［25］的实验结果相似，其原因可能与此阶段基质金属蛋白酶-9表达最强有关。而笔者同时观察到此时NOCC组的炎症反应更重，但与对照组相比差异无统计学意义。此发现提示尽管NOCC具有生物相容性，它对于机体毕竟还是一种异物。胶原化是腹膜损伤所引起的生理反应中永久性纤维化形成的指标。本实验发现胶原化在术后7 d最明显。其他研究也证实胶原合成在术后5～7 d达峰值［26-27］，从而有助于粘连的成熟［28-29］。

术后1周后是对于粘连形成很关键的纤维化发生的重要阶段，而在NOCC组此时纤维化并不明显。Costain等［19］的体内动物实验也提示NOCC不刺激纤维化。这可以解释NOCC组粘连强度显著降低的原因。还有研究发现术后14 d NOCC组粘连的范围和程度较对照组和生理盐水组均显著降低［30-31］。术后14 d，即使在腹腔内有血液存在的情况下，NOCC仍能减少粘连的形成和再形成［20］。

本实验发现与对照组相比，NOCC组术后4周后粘连的强度和类型均显著减轻，Diamond等［32］的临床研究也曾证实这一点。提示在NOCC完全吸收以后，其防粘连的作用还持续存在，而两组间组织的修复没有差异。Costain等［19］采用了三种不同的模型:腹主动脉吻合、大肠吻合、腹部皮肤切开来进一步评估NOCC对于手术切口愈合的作用，结果发现在所有模型中应用NOCC都没有影响切口愈合的强度。

综上，NOCC使用方便，可以迅速涂布在创面上全面覆盖创面，并且在有血液或体液存在的情况下也能发挥预防术后粘连的作用。NOCC在粘连形成的初始阶段能保持稳定，随后逐渐降解，可以显著减少粘连而不影响创面的愈合，因此是预防盆腹腔粘连的一种有效的措施。本研究将进一步通过特殊染色继续观察镜下胶原的变化，以更全面地评估NOCC对于镜下粘连情况的影响。

致谢:感谢中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所及曾海佩、孙继超在动物实验中给予的帮助;感谢北京协和医学院统计和流行病学教研室的韩伟助理研究员在实验设计和统计分析方面给予的帮助。

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Prevention of Postoperative Adhesions with N，O-carboxymethyl Chitosan in Rabbit: A Large-sample Gross and Histopathological Observation

REN Chang1，ZHAO Da-chun2，ZHU Lan1
1Department of Obstetrics＆Gynecology，2Department of Pathology，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100730，China

ZHU LanTel:010-69155649，E-mail:zhu_julie@vip．sina．com

ObjectiveTo assess the effect of N，O-carboxymethyl chitosan(NOCC)in preventing postoperative adhesion in a rabbit model．MethodsDouble uterine horn model was established in 220 female rabbits to induce postoperative adhesion．The rabbits were randomized to receive either adhesion-inducing operation only(control group)or adhesion-inducing operation+intraperitoneal injection of NOCC before closure(NOCC group)．All the operations were performed by one operator．Twenty-two rabbits from each group were euthanized at one of the five different time points(postoperative day 3，7，14，28，and 42)，and adhesion formation was scored both grossly(extent，type，and tenacity)and histopathologically(inflammation，fibrosis，and vascularization)．ResultsThe extent(P=0.0337)and tenacity of adhesion (P=0.0271)as well as inflammation(P＜0.0001)were lower in the NOCC group than in the control group on day 3．Fibrosis was less obvious in the NOCC group compared to the control group(P＜0.0005) before day 14．The tenacity scores of adhesion on day 14，28，and 42 were significantly lower in the NOCC group than in the control group(all P＜0.05)，while the type scores were obviously lower in the NOCCgroup on day 28 and 42(all P＜0.05)．ConclusionsTreatment with NOCC could reduce both gross and histopathological scores of surgery-induced abdominopelvic adhesions in rabbits．NOCC could be an effective therapy for preventing postoperative abdominopelvic adhesion．

N，O-carboxymethyl chitosan;postoperative adhesion;rabbit double uterine horn model;randomized controlled study

朱兰电话:010-69155649，E-mail:zhu_julie@vip．sina．com

R713

A

1674-9081(2016)05-0347-06

10.3969/j.issn.1674-9081.2016.05.005

2016-07-05)