禽流感病毒分子生物学诊断方法研究进展

李天芝，于新友，苗立中 ，沈志强

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

禽流感病毒分子生物学诊断方法研究进展

李天芝1，于新友，苗立中2，沈志强2

(1.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

禽流感是流感病毒引起的一种禽类传染病，同时也是一种人和动物之间的高度传染性疾病。本文综述了禽流感病毒分子生物学诊断方法研究进展，主要包括常规RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、荧光定量RT-PCR、环介导等温扩增等5种方法，对禽流感防控有一定的参考价值。

禽流感病毒；分子生物学；诊断

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒属禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV)引起的禽类一种急性、高度接触性传染病。主要侵害禽类的呼吸系统、神经系统及消化系统等。根据AIV致病力不同可分为高致病性病毒(HPAI)、低致病性病毒(PAI)和无致病性禽流感病毒。高致病性病毒可导致禽类大批死亡，并严重威胁着人类公共卫生安全，低致病性病毒低毒力株能明显降低家禽的生产性能，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强。AIV是有包膜的RNA病毒，形态不规整，外观形态为直径80~120nm的球状或长达数千纳米的丝状，其基因组由8条单股负链RNA组成，共编码10种蛋白质。AIV根据糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同分为16个HA亚型和10个NA亚型[1]，理论上可形成160种不同的禽流感病毒亚型，且不同亚型的病毒基因组会发生片段重组，造成病毒变异。世界动物卫生组织(OIE)将高致病性禽流感列为法定报告的动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病。该病不但严重危害家禽健康，也可感染人，具有重要的公共卫生意义。分子生物学检测方法以检测快度、灵敏度高、特异性好等特点已经广泛应用于细菌和病毒病的检测，并展示良好的应用前景。笔者就目前AIV分子生物学检测方法的研究进展进行综述，为AIV的防控提供参考。

1 常规RT-PCR方法

PCR方法是根据目的片段设计引物，借助仪器和DNA聚合酶体外大量扩增部分或全部目的片段，是一种快速、简便、特异的诊断方法。谭丹等[2]建立一种用于扩增H6亚型AIV HA基因的一步法RT-PCR检测方法，扩增片段为327bp。采用该方法对H6亚型AIV的尿囊液10倍倍比稀释样品进行检测，结果显示最低检出量为102.5EID50/ml。用该方法检测其他亚型AIV和鸡新城疫病毒(NDV）等病原均为阴性，具有良好的特异性。王云鹤等[3]建立了一步法检测H7N9亚型AIV RT-PCR方法，并采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。结果显示，用H7亚型特异性引物检测H1-H15亚型AIV和NDV等其他禽病病原，除H7亚型流感病毒外，其他样品均为阴性，用N9亚型特异性引物检测N1-N9亚型AIV和其他禽病病原，仅当前流行的H7N9亚型AIV样品有特异性目的条带，与其他N1-N9亚型AIV和鸡新城疫病毒(NDV)等其他禽病病原均无交叉反应。通过对H7N9亚型AIV尿囊液进行10倍倍比稀释检测，证实该方法最低检出量为1.4×102.5EID50.ml-1。乔明明等[4]根据GenBank中收录的AIV N9亚型高度保守的基因序列设计引物，通过优化反应条件建立AIV N9亚型RT-PCR检测方法，并对该方法进行灵敏度、敏感性、特异性试验和临床样品检测。建立了AIVN9亚型RT-PCR检测方法，用该方法检测时，H7N9、H10N9均呈阳性，而非 N9亚型的 AIV及NDV等其他禽传染病病毒均呈阴性，能检测到1/32血凝单位的H7N9AIV。罗思思等[5]根据GenBank中H6亚型 AIV的HA基因、N1亚型 AIV的NA基因和所有亚型AIV的M基因序列，分别设计并筛选出3对特异性引物，优化引物之间的浓度，建立了H6N1亚型AIV三重RT-PCR检测方法。结果显示，所建立的方法对H6N1亚型AIV可特异性扩增出447(H6亚型AIV)、325(N1亚型 AIV)和 669bp(AIV)目的条带，对 H6亚型 AIV扩增出447bp、669bp目的条带，对 N1亚型 AIV扩增出325bp、669bp目的条带，对其他亚型AIV仅扩增出669bp目的条带，对常见禽病病原体均未扩增出任何条带，该法对H6N1亚型AIV检测下限为0.1pg。

2 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是设计内外2种引物，同时扩增2次，该法能节省模板，且敏感性较高。郭捷等[6]针对H1亚型AIV血凝素(HA)基因保守区，设计合成了2对特异性引物，并优化反应条件进行巢式PCR反应，结果显示，该PCR方法能特异性检测到H1亚型AIV，其敏感性最低能检测到13.2fg/μl的H1亚型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法为H1亚型AIV的早期诊断及有效防制提供了快速、特异且敏感的检测方法。刘婷婷等[7]针对H3亚型AIV HA基因保守序列，设计并筛选出2对特异性引物，建立了H3亚型AIV巢式PCR检测方法，特异性试验结果表明该法只能检测到H3亚型AIV，对其他常见禽病病原体不扩增，敏感性试验结果表明该巢式PCR对H3亚型AIV检测下限为 1×103拷贝/μl，灵敏度比常规PCR高100倍。吴嫒琼等[8]针对H4亚型AIV HA基因保守序列，设计并筛选出2对特异性引物，通过优化反应条件，建立了H4亚型AIV套式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示，该法可特异性检测出H4亚型AIV，对其他常见禽病病原体无交叉，敏感性试验结果显示，该法对H4亚型AIV检测下限为360fg/μl，用该法对106份临床样品进行检测，临床样品检测结果与病毒分离结果一致。

3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的，在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或多种病原核酸，它具有快速、灵敏度高、特异性强等优点广泛用于各种临床疾病的快速诊断。郝明飞等[9]根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、AIV和NDV的基因序列，设计了3对特异性引物，建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术，并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明，该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为 174bp(DHV)、264bp(AIV)和 362bp(NDV)，且特异性、敏感性良好，能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。郭捷等[10]据H1亚型、H3亚型AIV HA基因和M基因的核苷酸序列，分别设计3对特异性引物，以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板，对三重PCR扩增条件进行优化，验证其特异性和敏感性，并对临床样品进行AIV检测。结果显示，H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带，其中302bp为H1亚型 HA基因、453bp为 M基因、626bp为 H3亚型HA基因，含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带，大小分别为302bp和453bp、453 bp和626bp，含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带(453bp)，而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV，对100个临床样品进行AIV检测，AIV总阳性率为36%，其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。袁万哲等[11]根据GenBank登录的AIV M1基因与NDV M基因核苷酸序列，设计用于扩增AIV与NDV的RT-PCR引物，建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明，该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38和27pg，可同时扩增出428bp(AIV)与297bp(NDV)的特异性片段，而对传染性法氏囊病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)与DHV的检测结果均为阴性。李海琴等[12]根据GenBank发表的 H5、H9亚型AIV HA基因和鸭坦布苏病毒(DTMUV)的NS5基因序列，分别设计了3对特异性引物，通过优化扩增条件，建立了同时检测H5亚型AIV、H9亚型 AIV和 DTMUV的多重PCR检测方法，对其特异性及敏感性进行检验，并在临床中进行初步应用。结果表明，该多重PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可同时扩增出大小分别为 732bp(H9亚型 AIV)、380bp(H5亚型 AIV)、250bp(DTMUV)的特异片段，利用本试验建立的多重PCR对其他鸭病病原体进行扩增结果均为阴性，利用这3对引物对H5、H9亚型AIV和DTMUV进行敏感性检测，结果显示最低检测极限分别为533pg·μl-1、56pg·μl-1和 6.6ng·μl-1。赵虹等[13]针对Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亚型AIV的M基因和H9亚型AIV的HA基因的保守序列，分别设计了3对特异性引物，建立了DTMUV和AIV多重PCR检测方法。该方法对混有H9亚型AIV和DTMUV的模板进行PCR扩增，得到了3个大小与试验设计相符的特异性扩增条带，对其他鸭病病原体进行PCR扩增，结果均为阴性。敏感性测定结果表明，该方法能检测到45pg的DTMUV、7.6pg的H9亚型AIV和76pg的M基因。屈素洁等[14]根据 GenBank中 H5、H7和 H9亚型 AIV 的 HA 基因序列的保守区域，利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物，预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化，建立了同时检测H5、H7和 H9亚型 AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强，对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性，敏感性高，H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为 10-4、10-4、10-2拷贝/μl。

4 荧光定量RT-PCR方法

荧光定量PCR技术是指采用荧光探针或SYBR GreenⅠ荧光染料通过连续监测荧光信号强弱的变化来测定特异性产物的量，不需要分离PCR产物，即能准确定量起始模板数。且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等优点。曹军平等[15]根据H5亚型AIV HA基因上的保守序列，设计合成引物，以H5亚型AIV HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线，建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明，本试验建立的标准曲线循环阈值 (Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为 0.995，灵敏度约为 8拷贝/μl，相当于 8个AIV颗粒，对NDV和其他禽病病毒无交叉反应，特异性好、重复性佳。徐守振等[16]通过RT-PCR扩增H9亚型AIV的HA基因保守片段，将其克隆到pMD18-T载体，经测序验证正确作为阳性质粒。以阳性质粒为标准品，建立SYBR Green I荧光定量RT-PCR的标准曲线。结果表明，该方法灵敏性可达74.3copies/μl，且特异性好、重复性佳。郭捷等[17]根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析，设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物，并以H1亚型AIV的cDNA为模版，构建重组阳性质粒。采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法，建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线。敏感性试验结果显示，扩增效率和标准误差分别为100.9%和0.0117，熔解曲线呈单一熔解峰。在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA，特异性试验结果显示，该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出，重复性试验结果显示，组内变异系数小于1%。刘婷婷等[18]根据H3和N8亚型AIV的HA和NA基因保守序列，设计合成了2对特异性引物和2条Taq Man探针，通过优化反应条件建立了H3N8亚型AIV一步法实时荧光定量RT-PCR。结果表明：该方法敏感型好，对H3N8亚型AIV检测敏感性达100个模板拷贝数。该方法特异性强，仅对H3和N8亚型AIV检测为阳性，应用该方法对96份临床样品进行检测，结果与病毒分离鉴定结果一致。周其伟等[19]针对H7N9AIV的HA和NA基因分别设计特异性引物和Taq Man-LNA探针，建立H7N9AIV特异性实时荧光RT-PCR快速检测方法。结果显示，该法对检测H7N9AIV株的灵敏度达到10PFU/ml。该方法特异性强，与其他亚型流感病毒株及呼吸道病原体无交叉反应。与对照方法相比，本研究方法的检测阳性符合率为99.07%，阴性符合率为100%，Kappa值为0.993。刘婷婷等[20]根据H3和H4亚型AIV HA基因的保守序列，分别设计合成特异性引物和用不同荧光基团标记的Taq Man探针。通过优化反应条件建立了H3和H4亚型AIV双重实时荧光定量RTPCR检测方法。结果显示，该法特异性好，敏感性达1000拷贝/μl，组内重复与组间重复性的平均变异系数均小于3%，应用该法对96份临床样品检测，结果与病毒分离鉴定结果一致。罗思思等[21]根据 GenBank中 H6、N1亚型 AIV的 HA、NA基因序列，设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。经反应条件优化，本试验建立了检测H6N1亚型AIV的二重荧光RT-PCR方法。该法特异性强，只对H6亚型和N1亚型AIV进行特异性扩增，对其他H亚型AIV、N亚型AIV及NDV、IBV等病原体的检测均为阴性，该法敏感性好，对H6N1亚型AIV的检测限为100拷贝/μl。

5 环介导等温扩增技术

环介导恒温扩增检测方法是一种新兴的分子生物学检测方法，已广泛应用于多种细菌病和病毒病的检测，以操作简单、检测速度快、敏感性好、特异性高等优势适合基层部门应用。蒋菲等[22]建立了H9亚型AIV的反转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)，检测方法，该方法使用了对应于H9亚型AIV HA基因的8个不同区域的6条特异引物，在63℃的等温条件下反应，最低可检测到103拷贝的目的基因重组质粒片段，较RT-PCR方法敏感10倍。通过对15种H亚型AIV、NDV、IBV的检测表明，该方法具有良好的特异性。在反应体系中使用钙黄绿素与Mn2+的混合溶液作为荧光指示剂可以用于RT-LAMP结果判定，并且其判断结果与浊度判断结果一致。对109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子临床样品进行检测，RT-LAMP与RTPCR检出阳性样本数分别为61份和46份，表明RT-LAMP方法阳性检出率高于RT-PCR。彭宜等[23]根据GenBank中AIV M基因序列，设计针对所有亚型AIV的通用检测引物，并对反应条件进行优化，建立了检测AIV的RT-LAMP可视化检测方法。结果表明，建立的检测方法对AIV总RNA最小检出限为10fg，灵敏度为RT-PCR的1 000倍，能特异地检测出所有不同的HA亚型AIV，对其他禽呼吸道病原体无扩增反应，该法快速，在常规水浴锅或金属恒温槽中50min就可完成，反应结束后不需开盖即可直接用肉眼根据反应液的颜色变化对结果进行判定。但晓雅等[24]利用改良RT-LAMP技术建立一种快速、灵敏的检测方法用于H9亚型AIV检测。该法根据H9亚型AIV血凝素(HA)基因保守区序列中的8个区段设计6条特异性引物，在恒温条件下进行核酸扩增反应，并以琼脂糖凝胶电泳和目视检查绿色荧光两种方法对扩增结果进行判定。结果表明，RT-LAMP的最小检测限为100fg，灵敏度比PT-PCR高100倍，且与H5亚型、H7亚型AIV，NDV无交叉反应。目视检查绿色荧光与常规琼脂糖凝胶电泳的判定结果一致。整个扩增检测过程在35min内即可完成。利用临床样本对RT-LAMP法进行验证，结果与RTPCR一致。由实时浊度分析得到的标准曲线，计算出临床样本中的病毒质粒拷贝数均在2×107~2×104之间。包红梅等[25]根据GenBank中登录的H7亚型AIV HA基因序列，设计引物，建立了一种基于RT-LAMP技术的H7亚型AIV诊断方法。结果显示，该方法对H7AIV RNA的最小检测限为0.1pg，灵敏度高于普通一步法RT-PCR 100倍，全部反应可在1.5h内完成，在反应体系中添加Fluorescent Detection Reagent染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明，该方法灵敏度高、特异性好，能够作为H7亚型AIV的快速诊断方法。石霖等[26]针对AIV M基因设计了4个不同区段的特异性引物，并对反应条件和反应体系进行优化，建立了AIV的RTLAMP方法。结果表明，该方法对AIV H1~H16亚型的检测结果均为阳性，而对其他禽类病毒的扩增均为阴性，具有良好的特异性。对AIV的最低检测限为13.43EID50/ml，灵敏度为普通一步RT-PCR的10倍，扩增反应可以在恒温水浴内60min内完成，在反应体系中添加荧光染料后，肉眼即可判定检测结果。该检测方法与RT-PCR方法和荧光定量RT-PCR方法对临床样品检测的符合率均为81.8%。陈兵等[27]将AIV、NDV和IBDV三种病毒性疾病作为一个检测整体，建立了对三种疫病同时进行筛选检测的多重RT-LAMP检测方法，建立了AIV、NDV和IBDV三种病毒实时荧光多重 RTLAMP检测方法，结果显示：该法可对AIV、NDV和IBDV同时进行筛选检测，灵敏度可达到10个基因拷贝，与单重LAMP检测的灵敏度相当，所建立的方法特异性强，与其他病原体无交叉反应。

6 小结与展望

随着分子生物学的发展，各国专家、学者先后建立了多种AIV分子生物学检测方法，

但这些方法各有优缺点，如常规PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法，虽然检测简单、快速、方便但不能精确定量，且敏感性有限，容易漏检。荧光定量PCR技术弥补了常规PCR方法的缺点，但由于所用仪器和试剂价格昂贵，成本高，且对操作人员有很高的要求，不利于其在基层兽医部门大规模推广应用。LAMP方法是一种新兴的方法，不需要特殊的仪器设备，操作简便，但敏感性太高，易导致假阳性结果，且单独使用任何一种方法都很难正确诊断该病，做好将各种方法结合起来，综合判断，不同单位可根据自身的情况选择适合的方法，

相信随着分子生物学的不断发展，将会有更多的新型分子生物学诊断方法建立，从而为鸭病毒性肝炎的诊断、分子流行病学调查和防控提供保障。

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