反相离子对色谱法同时测定黄柏八味片中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱含量

黄湘杰，朱 芹

（1．湖南省湘乡市人民医院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411100）

反相离子对色谱法同时测定黄柏八味片中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱含量

黄湘杰1，朱 芹2

（1．湖南省湘乡市人民医院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品药品检验所，湖南 湘潭 411100）

目的 建立同时测定黄柏八味片中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量的反相离子对色谱法。方法 色谱柱为Agilent C18柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)，流动相为0．5%磷酸溶液（用磷酸调pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸钠0．2 g）－乙腈（65∶35），柱温25℃，流速1．0 mL／min，检测波长284 nm。结果 盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱进样量分别在0．204～1．020 μg和0．506～2．530 μg与峰面积线性关系良好，平均回收率分别为100．18%和99．82%，RSD分别为0．14%和0．51%（n＝6）。结论 该法简便易行，结果可靠准确，组分分离良好，可用于制剂的质量控制。

高效液相色谱法；黄柏八味片；盐酸小檗碱；盐酸黄柏碱

黄柏八味片是由黄柏、栀子、甘草、红花等8味药材组方的中药复方制剂，具有清热凉血、固精功效，用于治疗肾热、尿路感染、尿中带血、经下过多等病症。其执行标准为国家食品药品监督管理局标准YBZ07192006，检验项目为黄柏的薄层色谱鉴别和盐酸小檗碱的薄层扫描含量测定，而盐酸小檗碱在黄连、黄柏、三颗针药材中均存在，以其作为含量测定指标不具有专属性。2010年版《中国药典（一部）》中也将盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量作为控制黄柏质量的指标之一[1]。为更好地控制本制剂的质量，保证临床用药的安全、有效，笔者采用反相离子对色谱法同时测定黄柏八味片中盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的含量，该法操作简便、快速、准确可靠，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；AUW－220D型电子天平（十万分之一，日本岛津公司）；UV2501型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）。盐酸小檗碱对照品(批号为110713－201212，含量为 86．7%)、盐酸黄柏碱对照品(批号为 111895－201202，含量为93．9%)均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；黄柏八味片（湖南兴蒙制药有限公司，批号为131201，140407，140910）；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm)；流动相：0．5%磷酸溶液（用磷酸调pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸钠 0．2 g）－乙腈（35∶65）[2－3]；流速：1．0 mL／min；检测波长：284 nm；柱温：25℃；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

称取盐酸小檗碱对照品、盐酸黄柏碱对照品，精密称定，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释制成每1 mL含盐酸小檗碱0．040 8 mg、盐酸黄柏碱1．011 mg的混合溶液，即得对照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相50 mL，超声处理（功率为400 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用流动相补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取缺黄柏黄柏八味片试样（自制），照供试品溶液制备方法，得阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：精密吸取2．2项下3种溶液各10 μL，注入液相色谱仪，依法测定。供试品溶液色谱中，与对照品溶液色谱相应保留时间位置有相同保留时间的色谱峰，阴性对照品溶液对测定无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：精密量取盐酸小檗碱对照品溶液和盐酸黄柏碱对照品溶液5，8，10，15，20，25 μL，分别注入液相色谱仪，按拟订色谱条件测定，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积 A为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程，盐酸小檗碱 Y＝2 000 000X＋25 852(r＝0．999 2，n＝6），盐酸黄柏碱 Y＝101 786X＋1 549．3(r＝0．999 1，n＝6）。结果表明盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱进样量分别在0．204～1．020 μg和 0．506～2．530 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密量取同一对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，按拟订色谱条件测定。结果盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱峰面积的 RSD分别为0．5%和1．2%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为131201）样品，精密称取6份，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下测定。结果每片样品中含盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱1．476 mg和 0．351 mg，RSD分别为 1．0%和 1．2%（n＝6），表明方法重复性良好。

图1 高效液相色谱图

稳定性试验：取同一供试品溶液，室温放置，每隔2 h测定1次，连续测定7次。结果盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱含量的 RSD分别为1．1%和1．5%（n＝7），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验：称取已测定含量样品（批号为131201，每片含盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱1．476 mg和0．351 mg），精密称定，除去糖衣，研细，取约0．5 g，置具塞锥形瓶中。再精密量取盐酸小檗碱对照品溶液(0．461 9 g／L)、盐酸黄柏碱对照品溶液(0．101 1 g／L)各3 mL，分别加入上述具塞锥形瓶中，按供试品溶液制备方法制备待测溶液。按拟订色谱条件测定含量并计算回收率。结果见表1。

表1 盐酸小檗碱及盐酸黄柏碱加样回收试验结果（n＝6）

2．4 样品含量测定

取3批样品，按拟订方法制备供试品溶液，依法测定，按外标法计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果(mg，n＝3)

3 讨论

检测波长的选择：采用二极管阵列检测器于200～400 nm波长进行光谱扫描，发现盐酸小檗碱于230 nm，265 nm，345 nm波长处均有较强紫外吸收，而盐酸黄柏碱最大吸收波长为284 nm。故选择 284 nm为检测波长。

提取溶剂的选择[4－5]：考察以甲醇、50%甲醇、盐酸－甲醇（1∶100）为提取溶剂，结果盐酸－甲醇（1∶100）酸性太大，不适合提取黄柏碱；甲醇、50%甲醇的极性偏小，也不适合提取极性较大的黄柏碱。经比较超声、回流2种提取方法，并设定不同的提取时间和不同的提取溶剂体积，最终确定最佳提取方式为加流动相50 mL，超声30 min。

流动相的选择：尝试了乙腈－0．5%三乙胺－0．2%磷酸、乙腈－0．02 mol／L磷酸二氢钾(磷酸调pH 3．0)、0．5%磷酸溶液（用磷酸调pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸钠0．2 g）－乙腈（35∶65）3种不同的流动相体系。结果发现乙腈－磷酸缓冲盐体系洗脱力强，其中反相离子对SDS的加入可以降低盐酸黄柏碱的极性，延长柱上保留时间并有效地防止拖尾并且峰形对称，分离度较好。故选择后者为流动相。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010:286，附录29．

[2]陈天朝，瞿来超．HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J]．中医研究，2011，24(4):23－25．

[3]张 莉，潘 超．高效液相色谱法同时测定二妙丸中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J]．中药新药杂志，2011，20(22): 2 262－2 264．

[4]祝晨 ，林朝展，莫建霞，等．HPLC法测定黄柏药材中盐酸小檗碱与黄柏碱的含量[J]．中药新药与临床药理，2004，15(4): 262－264．

[5]朱 芹，黄湘杰．HPLC法同时测定三黄散中黄芩苷和盐酸小檗碱的含量[J]．中国药师，2014，17(8):1 432－1 434．

Simultaneous Determination of Phellodendrine Chloride and Berberine Hydrochloride in Huangbaibawei Tablets by Reversed Phase Ion－Pair Chromatography

Huang Xiangjie1,Zhu Qin2
(1．XiangTan Institute for Food and Drug Control,Xiangtan,Hunan,China 411400; 2．Xiangxiang People′s Hospital,Xiangtan,Hunan,China 411100)

Objective To establish the reversed phase ion－pair chromatography method for the determination of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride in Huangbaibawei Tablets．Methods The Agilent C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used．The mobile phase was acetonitrile－0．5% phosphoric acid solution,adjusted to pH 4 with phosphoric acid,each 100 mL added sodium dodecyl sulfate 0．2 g(65∶35)．The flow rate was 1．0 mL／min,the column temperature was 25℃ and the detection wavelength was 284 nm．Results The injection volume of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride were in good linear relationship with the peak area in the ranges of 0．204－1．020 μg and 0．506－2．530 μg．The average recovery rates were 100．18% and 99．82%,and the RSD were 0．14% and 0．51%(n＝6)．Conclusion The method is simple,accurate,with good separation of the 2 components,which can be used as the quality control of Huangbaibawei Tablets．

HPLC;Huangbaibawei Tablets;berberine hydrochloride;phellodendrine chloride

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)03－0052－03

黄湘杰，男，大学本科，主管药师，研究方向为药物分析，（电子信箱）zhuqin1221＠163．com。

2015－03－18；

2015－09－10)