Rg1联合B族维生素对急性心肌缺血小鼠NO释放及Rg1入脑量的影响

陈银彬，王玉芳，侯志芳，王英平，符洋洋，郑培和※

(1．中国农业科学院特产研究所，长春?130112；?2．北京理工大学生命学院，北京?100000)

血管中内皮细胞在一氧化氮(NO)合成酶作用下合成NO，NO为血管舒张因子，能维持血管舒张状态[1]。心肌缺血小鼠血清NO释放量减少导致和加重了心肌缺血，能否促进NO释放量的增加是评价药物对心肌缺血模型是否具有治疗作用的一个重要指标。人参皂苷Rg1可通过与糖皮质激素受体结合促进血管内皮细胞产生NO对缺血心肌进行保护。血栓通注射液的主要成分就是Rg1，其对心肌缺血性疾病的治疗有肯定效果[2，3]。B族维生素也被报导能通过改善内皮细胞功能促进NO释放等途径来降低心肌缺血损伤[4，5]。人参皂苷Rg1联合B族维生素使用是否具有协同促进急性心肌缺血小鼠血清NO释放方面的作用研究未见报导，同时，人参皂苷Rg1的入脑量较低[6]，具有极大的提高空间。本研究从药物分布量是否改变的宏观角度去探究协同作用产生的可能机制，为临床应用人参皂苷Rg1联合B族维生素减轻急性心肌缺血损伤提供实验依据和理论基础。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

ICR小白鼠50只，雄性，体重20g±2g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，SPF级，合格证号：SCXK(吉)-2011-0004，饲养环境温度18℃～22℃，相对湿度50%～60%，定时通风排气，保持自然光照。动物每日喂食普通基础饲料，自由饮水，适应性喂养7d。

1.2 实验药品与试剂

人参皂苷Rg1单体化合物(纯度大于98%，吉林大学化学学院)；VB1(≥99%)、VB2(≥98%)、VB3(≥99%)、VB5(≥99%)、VB6(≥99%)、VB7(≥97%)、VB9(≥97%)、VB12(≥98%)(上海源叶生物科技有限公司)；盐酸异丙肾上腺素(济南凯恩医药科技有限公司)；内标化合物地高辛(纯度大于98%，成都植标化纯生物技术有限公司)；一氧化氮测定试剂盒(硝酸还原酶法，南京建成生物工程研究所)；甲醇和乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；氨水(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)。

1.3 实验仪器

细胞组织破碎仪(美国NEXT ADVANCE公司)；3-30K高速台式冷冻离心机(德国Sigma公司)；微量样品高灵敏度光吸收酶标仪(瑞士Tecan公司)；OasisHLB固相萃取小柱、UPLC/XEVO TQ超高压液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(美国Waters公司)；Milli-Q Advantage A10超纯水器(美国Millipore公司)；XS205DU电子天平(1/100 000，瑞士Mettler Toledo公司)。

2 方法

2.1 实验分组及急性心肌缺血模型制备

50只雄性ICR小白鼠适应性喂养7d后，随机分成对照组、模型组、Rg1组、B族维生素组、Rg1+B族维生素联合组5组，对照组和模型组给予溶药媒介0.5%羧甲基纤维素钠溶液，Rg1组给予人参皂苷Rg120mg/kg[2，7]，B族维生素组剂量为VB12.25mg/kg、VB22.25mg/kg、VB37.5mg/kg、VB53.45mg/kg、VB61.5mg/kg、VB722.5μg/kg、VB960μg/kg、VB121.5μg/kg[8，9]，联合组同时给予Rg1(20mg/kg)和B族维生素，用法同上。连续灌胃给药10d，记录体重。除对照组外，其他4组在第8天、第9天和第10天在给药30min后腹腔注射盐酸异丙肾上腺素(ISO-HCl)20mg/kg，制造急性心肌缺血小鼠模型[10～12]。

2.2 样品收集

在第10天注射盐酸异丙肾上腺素3h后摘眼球取血并处死小鼠，取出完整大脑，用生理盐水冲洗后滤纸吸干，用锡纸包好放-80℃冰箱保存待测。

2.3 血清NO含量测定

使用一氧化氮测定试剂盒(硝酸还原酶法)，严格按照使用说明书操作，用微量样品高灵敏度光吸收酶标仪检测。

2.4 脑组织样品前处理

准确称取Rg1组和联合组小鼠大脑组织0.4g放入离心管中，加入1.2mL生理盐水，利用细胞组织破碎仪匀浆2min，超声10min，然后10 000r/min 4℃离心10min，取1.0mL上清液放入另一干净离心管中，重复上述提取步骤1次，合并上清液。在上清液中加10μL内标地高辛(10μg/mL)后过OasisHLB固相萃取小柱，小柱首先采用3.5mL甲醇活化，3.5mL去离子水平衡，然后上样，再加1.0mL去离子水洗脱杂质，最后用1.0mL纯甲醇洗脱目标物。洗脱液40℃下氮气吹干后，100μL 50%甲醇水溶液复溶待测。

2.5 LC-MS/MS检测条件

2.5.1液相色谱条件色谱柱：ACQUIYT UPLCBEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相：A为乙腈(含1mmol/L氨水)，B为去离子水(含1mmol/L氨水)；梯度洗脱：0min～1min 28%～35%A，1min～1.5min 35%～75%A，1.5min～2.5min 75%A，2.5min～3min 75%～28%A，3min～4min 28%A；流速：0.4mL/min；进样体积：5μL；柱温35℃。

2.5.2质谱条件ESI离子源；负离子模式检测；毛细管电压：2.8kV；源温：150℃；脱溶剂气流速：1000L/Hr；温度：450℃；锥孔气流速：50L/Hr；碰撞气流速：0.16mL/min；多反应监测(MRM)采集模式；人参皂苷Rg1定量离子对：799.5957>637.4817(锥孔电压52V，碰撞能量22V)；人参皂苷Rg1定性离子对：799.5957>475.4191(锥孔电压52V，碰撞能量34V)；内标地高辛定量离子对：779.6530>649.5557(锥孔电压66V，碰撞能量32V)；内标地高辛定性离子对：779.6530>475.4506(锥孔电压66V，碰撞能量44V)。

2.6 统计方法

3 结果与分析

3.1 人参皂苷Rg1和B族维生素对急性心肌缺血小鼠血清NO释放量的影响

人参皂苷Rg1组、B族维生素组和联合组血清NO释放量分别为65.09μmol/L、67.97μmol/L和88.13μmol/L，人参皂苷Rg1和B族维生素血清NO释放量显著高于模型组，表明这2种物质都具有提高急性心肌缺血小鼠血清NO释放的作用，同时，联合组促NO释放效果明显优于各单一用药组(P<0.01)。结果见表1。

表1人参皂苷Rg1和B族维生素对急性心肌缺血小鼠血清NO释放量的影响

组 别GroupNO释放量(μmol/L)TheNOlevel对照 Control8530±1514∗∗模型 ISO-inducedmodel5108±998△△人参皂苷Rg1 GinsenosideRg16509±995∗△△B族维生素 Bvitamins6797±1000∗△△Rg1+B族维生素联合Rg1andBvitaminscombined8813±1376∗∗

注：与模型组相比，*．差异显著(P<0.05)，**．差异极显著(P<0.01)；与联合组相比，△．差异显著(P<0.05)，△△．差异极显著(P<0.01)。

Note：Compared with ISO-induced model group,*.indicates significant differences(P<0.05),**.indicates extremely significant differences(P<0.01);compared with combined group,△.indicates significant differences(P<0.05),△△.indicates extremely significant differences(P<0.01).

3.2 Rg1入脑量检测结果

3.2.1B族维生素对人参皂苷Rg1入脑量的影响

利用液-质联用法(LC-MS/MS)对Rg1组和Rg1+B族维生素联合组小鼠大脑组织中人参皂苷Rg1含量进行检测。检测采用多反应监测(MRM)模式，信号灵敏(图1)。经检测得出各样品中人参皂苷Rg1浓度，并根据脑组织重量换算成质量含量。定量分析发现，人参皂苷Rg1入脑量较低，联合组小鼠大脑组织中Rg1含量极显著高于单一给药的Rg1组(P<0.01)，提高了约6倍(表2)。

A.Total ion chromatogram(TIC) of Rg1in brain tissue;B.Extracted ion chromatogram(EIC) of quantitative fragment ions of Rg1in brain tissue;C.EIC of qualitative fragment ions of Rg1in brain tissue

图1脑组织样品Rg1总离子流色谱图及提取离子流色谱图

Fig.1TICandEICofRg1inbraintissue

表2B族维生素对人参皂苷Rg1入脑量的影响

组 别Group脑组织中Rg1含量(μg/kg)ThebrainconcentrationofRg1人参皂苷Rg1 GinsenosideRg1093±042Rg1+B族维生素联合Rg1andBvitaminscombined609±460∗∗

注：与Rg1组相比，*．差异显著(P<0.05)；**．差异极显著(P<0.01)

Note：Compared with Rg1group,*.indicates significant differences(P<0.05);**.indicates extremely significant differences(P<0.01).

3.2.2LC-MS/MS检测方法学考察小鼠空白脑组织提取液配制成分别为80ng/mL、60ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、1ng/mL标准工作液，经前处理后进行LC-MS/MS检测，测得人参皂苷Rg1在1ng/mL～80ng/mL范围内呈良好的线性关系(r=0.999 055)。将低浓度的标准工作液以小鼠空白脑组织提取液稀释，经前处理后测得该方法检出限为0.25ng/mL(S/N=3)，定量限为0.8ng/mL(S/N=10)。利用小鼠空白脑组织提取液进行50ng/mL、20ng/mL、2.5ng/mL 3个添加水平的回收实验，经前处理后测得回收率为85%～96%，同一浓度工作液连续进样测得日内精密度为2.2%，日间精密度为4.8%。

3.3 小鼠血清NO释放量和Rg1入脑量相关性分析结果

分别对Rg1组和Rg1+B族维生素联合组小鼠血清NO释放量和Rg1入脑量进行相关性分析(图2)。由图2可知，联合组NO释放量与Rg1入脑量成极显著正相关，相关系数为0.844；Rg1组NO释放量与Rg1入脑量成极显著正相关，相关系数为0.789；2组结果都表明，NO释放量与Rg1入脑量呈极显著正相关。同时比较2组结果也可发现，联合组NO释放量与Rg1入脑量都比单一给药的Rg1组要高，也印证了NO释放量与Rg1入脑量成正相关。

4 讨论

近年研究显示，合成NO的一氧化氮合成酶主要有原生酶(cNOS)和诱生酶(iNOS)2大类。cNOS主要分布于血管内皮细胞、神经组织和血小板中；iNOS主要分布于巨噬细胞和血管平滑肌细胞中。NO对血管平滑肌和气管平滑肌具有舒张作用，并具有介质及细胞信号传递等调节功能，是机体内重要的信使分子、效应分子和免疫调节分子。病理情况下，血管内皮的保护性机制减弱或消失，主要的血管收缩因子内皮素和主要的血管舒张因子NO释放失衡，收缩因子占优势，导致和加重了心肌缺血、高血压等心血管疾病的发生，提高血清NO的释放对减轻心肌缺血损伤具有极其重要作用[13]，血清NO释放量的提高是评价药物对心肌缺血疾病是否具有治疗作用的重要指标。

*．显著相关(P<0.05)；**．极显著相关(P<0.01)

Note：*.indicates significant differences(P<0.05);**.indicates extremely significant differences(P<0.01).

图2联合组和Rg1组NO释放量与Rg1入脑量相关性分析

Fig.2CorrelativeanalysisbetweentheNOlevelandthebrainconcentrationofRg1incombinedgroupandRg1group,respectively

本实验发现，人参皂苷Rg1联合B族维生素使用具有协同促进急性心肌缺血小鼠血清NO释放的作用，并且人参皂苷Rg1联合B族维生素给药后Rg1的入脑量极显著高于单独给予人参皂苷Rg1的入脑量；通过相关性分析发现，血清NO释放量和Rg1入脑量具有极显著正相关。人参皂苷Rg1具有改善脑缺血、心肌缺血、改善学习记忆功能、促进智力[14，15]等广泛的药理作用，人参皂苷Rg1在大脑神经调节过程中具有重要作用，但是进入脑组织中的量一直较低，具有很大的提高空间。药物入脑量提高在一定范围内会产生更大的调节作用，合成NO的合成酶之一cNOS在神经组织中也有分布，同时，相关性分析也发现，血清NO释放量和Rg1入脑量具有极显著正相关。综上，提高Rg1入脑量可能是人参皂苷Rg1与B族维生素联合使用协同促进NO释放的主要途径之一，具体调节机制值得进一步研究。

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