家蚕茧壳水解物对小鼠细胞免疫功能的影响

王晶晶，张泽峰，邓红梅，田钰琪，陈益红，王春梅

(北京中医药大学，北京?100102)

家蚕起源于我国，是公认的保健和滋补食疗珍品[1]，现代研究发现，家蚕的蚕丝由丝素蛋白和丝胶蛋白2部分组成[2]，蛋白质含量高达98%，富含大量氨基酸，其中甘氨酸和丙氨酸的含量尤其高，因此，它在医药保健方面的作用越来越受到人们的重视。传统中药茧黄是采用家蚕茧壳直接水煮制作而成，药用效率较低。现代研究发现，对家蚕茧壳进行水解处理[3]，得到的水解物具有抗氧化[4]、抗肿瘤[5]、降血糖[6]等作用。前期研究发现，家蚕茧壳水解物对小鼠具有免疫调节作用[7]。本试验研究了家蚕茧壳水解物对细胞免疫作用的影响及作用方式，为家蚕茧壳水解物免疫调节机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂家蚕茧壳水解物(淡黄色粉末，韩国吾儿得伟有限公司，总氨基酸含量≥89.0%)；抗体芯片试剂盒(RayBiotech公司)；MTT、乙二胺四乙酸(北京拜尔迪生物技术有限公司)；1640培养基(Gibco公司)；无支原体胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；异丙醇、盐酸(北京化工厂)；磷酸盐缓冲液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；姬姆萨染液(国药集团化学试剂北京有限公司)；TLA、GMAg、ConA、LPS(Sigma公司)。

1.1.2试验动物雄性6周龄BALB/c小鼠，SPF级，体重20g±2g，购自北京实验动物科技有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0004。

1.2 实验分组及家蚕茧壳水解物灌胃方法

将雄性BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只。试验设50mg/kg、200mg/kg、500mg/kg 3个剂量组(分别称低剂量、中剂量、高剂量组)，另设PBS为溶剂对照组(CK)。经灌胃给予，灌胃量200μL。各试验组均连续灌胃6周测定相应指标。

1.3 小鼠免疫性状指标检测

1.3.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖试验参照文献[8]的方法，以试验组与空白组OD值(570nm)的差值代表淋巴细胞增殖能力。

1.3.2血液涂片及白细胞分类计数末次给药后，从每只小鼠的心脏采取500μL的血样。将部分血样涂在载玻片上，利用快速染色法染色，用于白细胞分类计数。

1.3.3FACS分析小鼠外周血T淋巴细胞亚群比率变化利用“1.3.1”中制备的脾细胞悬液，每组5×105个单脾细胞，利用流式细胞仪比较脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比率。

1.3.4小鼠细胞因子检测利用“1.3.1”中制备的脾细胞悬液，参考文献[9]的方法进行检测，利用影像分析器得到影像，然后利用影像分析程序进行数据分析。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 18.0软件对所有检测数据进行统计分析。检测数据先经方差齐性检验，再进行方差分析，如组间差异有显著性，继续进行多个试验组与一个对照组间均数的两两比较；对非正态分布或方差不齐的数据资料进行适当的变量转换，待满足“正态方差齐”要求后，用转换所得的数据进行统计处理。

2 结果

2.1 家蚕茧壳水解物对ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

灌胃中剂量家蚕茧壳水解物可极显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率(P<0.01)，高剂量组也表现出显著作用(P<0.05)，和对照组相比，中剂量组提高的量是对照组的4倍。表明家蚕茧壳水解物具有促进正常小鼠脾淋巴细胞增殖的能力(图1)。

Compared with the CK,*.showsP<0.05;**.showsP<0.01.The following figure is the same.

Fig.1Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesonthelymphocyteproliferationactivityinmice

2.2 白细胞计数

摄取家蚕茧壳水解物的小鼠和CK组小鼠相比，血液中的嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞的比率都出现了明显的变化，其中，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的比率下降，单核细胞和淋巴细胞的比率上升，中剂量组淋巴细胞比率增加最为明显(P<0.01，图2)。

Fig.2Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesontherelativequantityoftheleucocytesinmice

2.3 小鼠外周血T淋巴细胞亚群比率变化

对不同处理的小鼠外周血中T淋巴细胞中CD4+T和CD8+T细胞的数量进行分析，与对照组相比，摄取家蚕茧壳水解物小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞都有明显增加(P<0.05)。尤其是中剂量组小鼠CD4+T细胞数量增加了12%，CD8+T细胞的数量增加了8%(图3)。

Fig.3EffectofsilkcocoonshellhydrolysatesontheTlymphocytesubsetsofperipheralbloodofmice

2.4 家蚕茧壳水解物对小鼠分泌细胞因子的影响

此次检测一共跟踪了22种细胞因子的变化，分泌最活跃的是IL-6、IL-10、IL-17、MCP-1、IFN-γ 5种细胞因子，尤其是中剂量组中IL-17、IL-6、IFN-γ的分泌最为活跃，其中IL-17的分泌量是对照组的4.5倍(图4)。

图4 家蚕茧壳水解物对小鼠分泌细胞因子的影响

Fig.4Effectofsilkcocoonshellhydrolysatesoncytokinesecretioninmice

3 讨论

机体免疫系统是由非特异性免疫、体液免疫和细胞免疫共同构成的防御系统，其中，细胞免疫的增强使得机体对抗外部抗原的免疫力增强。T细胞在细胞免疫发挥了重要的作用，当外来抗原入侵机体细胞时，致敏T细胞及其释放的细胞因子协同作用对抗抗原。外周淋巴器官或外周血液中的T细胞分为CD4+和CD8+2个主要亚群。CD4+T细胞代表辅助性T细胞，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能；CD8+T细胞通过直接杀伤作用，主要负责对靶细胞的清除。检测脾淋巴细胞的增殖力、T淋巴细胞亚群比率、细胞因子分泌量，可反映细胞免疫的功能[10]。本研究选取了上述3项指标和白细胞总量变化考察了家蚕茧壳水解物对细胞免疫的作用。结果表明，家蚕茧壳水解物能够增加正常小鼠白细胞总量，增强ConA诱导的脾淋巴细胞的增殖能力，增加T细胞中CD4+和CD8+的比率，增加促进免疫功能的细胞因子的分泌。这些结果说明，家蚕茧壳水解物能够通过多种方式增强小鼠的细胞免疫功能。

国内对蚕丝蛋白功效的研究已有几十年，日本的研究也证实了蚕丝蛋白对人体的营养保健功能[11]。有研究报道，蚕丝蛋白中丝素蛋白的氨基酸构成不同于一般食用蛋白质，具有护肝、降压、防血栓、降血糖等保健作用；丝胶蛋白具有很强的抗氧化活性和对酪氨酸酶的抑制作用[12]。有文献表明，在免疫调节方面，蚕丝蛋白中大小不同的多肽发挥了作用[13～15]。本研究中观察了蚕茧壳水解物灌胃小鼠后的22种细胞因子变化发现，IL-17、IL-6、IFN-γ 3种细胞因子分泌最活跃，这为进一步机制研究提供了思路。在本研究中，所用样品为多肽和氨基酸的混合物，具体哪些多肽起作用有待进一步研究。

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