Bcl- 2基因多态性、IL- 21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮易感性的相关性分析

李声东　　陈阿琼宁波市医疗中心李惠利医院风湿免疫科，浙江宁波　315003



Bcl- 2基因多态性、IL- 21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮易感性的相关性分析

李声东陈阿琼
宁波市医疗中心李惠利医院风湿免疫科，浙江宁波315003

[摘要]目的研究Bcl-2基因多态性、IL-21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮易感性的相关性。方法随机选取2012年5月～2015年5月间在我院接受治疗的200例系统性红斑狼疮患者作为研究对象，将其分为实验组；选取健康研究对象200例，分为对照组。观察两组研究对象Bcl-2主要基因型分布、等位基因分布以及IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状的关系和Bcl-2与IL-21协同作用分析。结果两组研究对象Bcl-2主要基因分布差异明显，部分基因类型差异具有统计学意义（P＜0.05）；两组研究对象Bcl-2常见等位基因分布差异明显，部分基因类型差异具有统计学意义（P＜0.05）；IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状密切相关；同时携带Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的个体较单独携带Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的个体患病的风险性更高。结论Bcl-2基因多态性、IL-21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮发病密切相关，致病原因可能为两者直接参与系统性红斑狼疮发病部位或附近某个易感位点存在连锁不平衡，两者易感等位基因分布在决定系统性红斑狼疮易感性中存在协同作用。

[关键词]Bcl-2基因多态性；IL-21单核苷酸多态性；系统性红斑狼疮易感性；相关性

系统性红斑狼疮是一种常见的自身免疫性结缔组织疾病，发病原因一般包括家族遗传、生活环境以及免疫系统异常，该病涉及全身多个系统和器官[1]，其主要特征为免疫系统异常、多种自身抗体生成、补体活化以及免疫复合物沉积[2]。系统性红斑狼疮多发于17～48岁的育龄女性，其临床症状复杂多样，并且极易反复发作，对患者的生活质量产生了严重的影响[3]。目前，医学界广泛开展了对系统性红斑狼疮发病机制的研究，但具体原因尚不明确。为了进一步探讨研究Bcl-2基因多态性、IL-21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮易感性的相关性，本研究随机选取了2012年5月～2015年5月间在我院接受治疗的200例系统性红斑狼疮患者进行研究，现将研究情况报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

随机选取2012年5月～2015年5月间在我院接受治疗的200例系统性红斑狼疮患者作为研究对象，将其分为实验组，其中男20例，女180例，年龄25～72岁，平均（41.25±2.55）岁。另选取同期健康研究对象200例为对照组，其中男24例，女176例，年龄24～71岁，平均（41.55±2.45）岁。两组患者年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，本研究所有患者均自愿参与本研究。

1.2诊断标准

所有实验组选取研究对象均符合美国风湿病学会修订的系统性红斑狼疮分类标准[4]，患有颧部红斑、盘状红斑、光过敏、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎、肾脏病变、神经系统异常、血液学异常、免疫学异常、抗核抗体中四项以上者即可确诊为系统性红斑狼疮。

1.3纳入及排除标准

1.3.1纳入标准实验组纳入标准：符合上述诊断标准者。对照组纳入标准为：①不符合系统性红斑狼疮分类标准中的任意一条；②研究对象本人以及其直系亲属不具有自身免疫性疾病史；③无重大疾病及家族史；④未长期使用激素以及免疫抑制剂等药物。

1.3.2排除标准实验组排除标准为：①患有其他全

身性疾病者；②意识不清晰无法完成调查表者。

1.4研究方法

具体过程如下：①抽取两组研究对象外周静脉血5 mL，放置在抗凝管中，运送过程中注意对样本进行避光、保温（温度应控制在1℃～4℃之间）以及防止溶血等措施，随后提取所有样本的基因组DNA，置-80℃的低温冰箱中存储备用；②对Bcl-2以及IL-21微卫星引物设计和合成，在基因数据库中通过输入序号找到Bcl-2及IL-21基因端的序列，取其ATG密码子端上游570 bp处的一个微卫星标记，完成引物合成之后，对其进行去离子水溶解，配置成10 pmol/μL浓度，并在-20℃的环境下进行避光保存；③聚合酶链反应体系扩充：聚合酶链反应体系包括去离子水2.02 μL dNTP 0.2 μL，Bcl-2及IL-21正链引物0.2 μL、负链引物0.2 μL，Tsp DNA聚合酶0.05 μL，DNA模板2.5 μL。聚合酶链反应循环设置：95℃变性2 min，之后94℃变性1 min、60℃30 s、72℃15 s，共进行35个循环，最后一个循环72℃9 min，并在5℃的温度中进行保存；④配置浓度为5.8％的Long Ranger变性凝胶，对聚合酶链反应的生成物按照1∶10的比例进行去离子水稀释后，取1.5 μL和3.5 μL Loading Buffer混合均匀之后进行95℃变性3 min，并放置在冰上；取4 μL在36孔鲨齿书上上样。使用ABI373进行电泳和检测，参数设置为Genescan模式、电流20 mA、电压1500 V、功率30 W，并将温度控制在40℃，在上下电泳槽中放置1× Tris硼酸缓冲液。

1.5观察指标

观察两组研究对象Bcl-2主要基因型分布、等位基因分布以及IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状的关系和Bcl-2与IL-21协同作用分析。

1.6统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析和处理，计数资料采取率（％）表示，组间率采取χ2检验；P＜0.05为差异统计学意义，并对Bcl-2与IL-21协同作用进行Logistic回归分析。

2　结果

2.1两组研究对象Bcl-2主要基因频率的分布

通过对比可以发现，两组研究对象Bcl-2主要基因分布差异明显，部分基因类型差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　两组研究对象Bcl-2主要基因分布对比[n（％）]

表2　两组研究对象Bcl-2常见等位基因分布对比[n（％）]

表3　IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状的关系[n（％）]

2.2两组研究对象Bcl-2常见等位基因频率的分布

通过对比可以发现，两组研究对象Bcl-2常见等位基因分布差异明显，基因型191、193、195、197以及203差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状的关系见表3。

2.4Bcl-2与IL-21协同作用分析

通过观察可以发现，同时携带Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的个体较单独携带Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的个体患病的风险性更高，见表4。

表4　两组研究对象Bcl-2与IL-21易感等位基因协同作用分析对比[n（％）]

3　讨论

系统性红斑狼疮是由多种病因共同导致的一种复杂的结缔组织性疾病[5]，一般认为该病与遗传、生活环境以及感染和药物等有关，但具体病因尚不明确[6]。细胞因子是淋巴细胞或者单核细胞等受到刺激而生成、分泌出的一类具有生物学活性的小分子蛋白物质[7]。当淋巴细胞出现非正常活化和增长时，会产生多种自身抗体、细胞因子会表达异常[8]，进而导致人体免疫系统调节紊乱，对系统性红斑狼疮的发病以及发展有着非常重要的推动作用[9]。

Bcl-2具有抑制或者延缓一系列刺激诱导的细胞凋亡的作用[10]。在过度表达Bcl-2的转基因生物体内，B细胞存活时间得到延长，容易引发大量自身抗体[11]，并出现狼疮样肾小球肾炎[12]。有临床研究指出[13]，系统性红斑狼疮患者，尤其是处于活动期的患者，体内淋巴细胞过度表达Bcl-2基因，表明系统性红斑狼疮患者淋巴细胞可以逃逸细胞凋亡。并能够处于活化增殖的状态，引起自身免疫系统的失常[14]。

IL-21单核苷酸在细胞信号的转导中发挥着重要的作用，同时能够在多种自身免疫性疾病病理生理学机制中起到重要作用[15]。IL-21具有促炎和抗炎作用[16]，同时，IL-21可以刺激B细胞分化产生抵抗DNA的自身抗体[17]，而ds-DNA抗体又能够发挥反作用，刺激IL-21的增加[18]，两者互相作用，导致了病情的发展[19]。根据IL-21的这一特性，可以将其作为系统性红斑狼疮患者的诊断标准和治疗效果观察指标[20]。

在本研究中，通过使用荧光标记卫星分型技术对200例系统性红斑狼疮患者以及200例健康研究对象进行观察对比，并对Bcl-2与IL-21协同作用进行Logistic回归分析可以发现，两组研究对象Bcl-2主要基因和常见等位基因分布差异明显，部分基因类型差异具有统计学意义（P＜0.05），并且IL-21单核苷酸多态性rs2243188位点等位基因及其基因型分布与系统性红斑狼疮临床症状密切相关，同时携带Bcl-2 195 bp和IL-21 138 bp易感等位基因的个体较单独携带Bcl-2 195 bp或IL-21 138 bp易感等位基因的个体患病的风险性更高。

综上所述，Bcl-2基因多态性、IL-21单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮发病密切相关，致病原因可能为两者直接参与系统性红斑狼疮发病部位或附近某个易感位点存在连锁不平衡。Bcl-2基因多态性与IL-21单核苷酸多态性易感等位基因分布在决定系统性红斑狼疮易感性中存在协同作用。由于本研究选取的患者处在不同的疾病阶段、部分患者仍在使用治疗风湿病的药物，所以对本研究的研究结果产生了一定的影响作用。此外，本研究选取的样本数量较少，研究结果可能不具有广泛的代表性，更广泛、更深刻的与系统性红斑狼疮易感性的研究将在以后得以开展。

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Correlation analysis of Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism and susceptibility of systemic lupus erythematosus

LI Shengdong CHEN Aqiong
Department of Rheumatism and Immunology, Lihuili Hospital of Ningbo Medical Treatment Center, Ningbo 315003, China

[Abstract]Objective To investigate the correlation of Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism and susceptibility of systemic lupus erythematosus. Methods Randomly selected 200 patients with systemic lupus erythematosus who received treatment in our hospital from May 2012 to May 2015 were randomly selected and divided into the experimental group, then 200 healthy subjects were selected and divided into the control group. The relationship between Bcl -2 major genotypes distribution, allele distribution, IL -21 single nucleotide polymorphism rs2243188 locus and its genotypes distribution and clinical symptoms of systemic lupus erythematosus were observed, the relationship between which and synergistic effect between Bcl-2 and IL-21 was analyzed. Results There were significant differences in the distribution of major genes of Bcl-2 in the two groups of study subjects, and the differences of partial gene types were statistically significant（P＜0.05）. There were significant differences in the distribution of common alleles between the groups of research subjects, and the differences of partial gene types were statistically significant（P＜0.05）. The allele gene of IL-21 single nucleotide polymorphism rs2243188 locus and its genotype distribution were closely related to the clinical symptoms of systemic lupus erythematosus. The risk of disease of people who carried with 195 bp Bcl-2 and 138 bp IL-21 susceptible allele genes was higher than those who carried 195 bp Bcl-2 or 138 bp IL-21 allele gene alone. Conclusion Bcl-2 gene polymorphism, IL-21 single nucleotide polymorphism are closely related to systemic lupus erythematosus, and the cause of the disease may be that both the two directly involved in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus or there is a linkage disequilibrium in the vicinity of some susceptible locus.

[Key words]Bcl-2 gene polymorphism; IL-21 single nucleotide polymorphism; Susceptibility of systemic lupus erythematosus; Correlation

收稿日期：（2015-09-16）

[基金项目]浙江省宁波市第二批科技项目（2015A610179）

[中图分类号]R593

[文献标识码]A

[文章编号]1673-9701（2016）02-0001-04