绵羊抗肠道寄生虫病育种研究进展

王　　冰，赵贵平，苟锡勋，高维明（新疆畜牧科学院，新疆　乌鲁木齐　800；新疆拜城种羊场，新疆　拜城　8400；新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆　乌鲁木齐　800）



绵羊抗肠道寄生虫病育种研究进展

王冰1，赵贵平2，苟锡勋2，高维明3
（1新疆畜牧科学院，新疆乌鲁木齐830011；
2新疆拜城种羊场，新疆拜城842300；
3新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆乌鲁木齐830011）

摘 要：肠道内寄生虫病是影响养羊业发展的最重要疾病之一。基于化学驱虫药的防治方法对绵羊内寄生虫的控制起到了有效的作用，但寄生虫抗药性不断增加以及畜产品中药物残留问题对新的替代方法研究提出了要求。大量研究证明绵羊品种间和品种内存在寄生虫抗性差异，这种已有遗传变异为通过育种方法提高绵羊抗性提供了可能性，而目前一些绵羊抗性群体的成功培育则为这一方法的实施提供了证据。现在寄生虫抗性的选择主要基于粪便中虫卵数（FEC），而抗性遗传标记的发现将会提供更为有效的选择方法。目前已有许多研究致力于寻找与寄生虫抗性关联的分子遗传标记。包括基因定位和基因表达的功能基因组学研究也正在进行，且已有几个研究发现了一些抗性表达差异基因。通过数量遗传学、功能基因组学以及大规模数据收集、流行病学预报等多领域的综合研究，将为绵羊抗寄生虫病育种提供更大的契机。

关键词：绵羊；内寄生虫；QTL；基因表达；育种

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.03.002

1　前言

肠道寄生虫病是影响养羊业发展的重要疾病之一，其一方面通过降低食欲和营养摄入量而导致绵羊体重、生产性能下降，另一方面病羊粪便又会污染草场并引发寄生虫的进一步扩散。基于化学驱虫药的防治方法在过去40年里对肠道寄生虫的控制起到了有效的作用，但寄生虫对驱虫药的抵抗力也在不断增加。为了改善这种不利局面，过去10余年已在化学控制替代方法筛选方面进行了大量研究。主要包括草场管理、贫血症个体的有效鉴别和治疗、口服缩合丹宁制剂、接种疫苗及生物控制等。这些方法因存在易引起中毒、增加劳动强度与成本及产品尚不成熟等缺陷，阻碍了在生产中的应用。理论上来说，控制寄生虫病最理想和最适用的方法是培育抗寄生虫病的品种，其有以下三方面的优势：一是抗性品种本身能抑制寄生虫在其肠道内的寄生，在提高生产性能的同时也降低了寄生虫病的防治成本；二是避免了化学抗虫剂等引起的药物残留等问题；三是抗性品种粪便中虫卵含量少，减少了草场污染并进而降低了草场管理成本。

2　现有群体存在寄生虫病抵抗力的遗传差异

动物对寄生虫抵抗力的不同受许多因素影响，而这种不同是否存在遗传差异是能否进行抗病育种的基础。大量对羊肠道寄生虫病抗性遗传基础的研究表明，在绵羊品种间和品种内均存在寄生虫抗性的遗传变异。研究发现起源于湿度大、气温高、寄生虫病高发地区的绵羊品种多具寄生虫抗性，如Barbados Blackbelly羊、St.Croix羊、Red Maasai羊及Florida羊等[1,2]。这些品种在高寄生虫感染和不使用驱虫药的环境条件下，经过长期自然选择，具抗性个体存活、繁衍形成了对寄生虫的较强抵抗力。因此一般来说，越是在在持续强的疾病感染环境下形成的羊的品种，相对于引进品种对疾病的抵抗力和耐受力越强[3]。此外，Sayers等（2005）[4]对绵羊品种内抗病遗传差异的研究作了综述，主要包括在Blackface mountain、Soay、Suffolk、Texel及Merino等绵羊品种内均存在不同寄生虫抗性个体。寄生虫抗性在绵羊品种间和品种内存在变异的大量证据说明，抗病育种是补充驱虫药抵抗感染的一个可行的选择。

3　寄生虫抗性性状的选择

利用家畜群体内遗传变异进行抗病育种的一个前提是需要确定能进行种畜遗传评定的选择性状。与许多经济性状不同，抗寄生虫病性状表现不仅受动物的年龄、营养水平、健康状况的影响，也受感染程度、以前是否被感染等因素的影响，还受寄生虫的种类、摄食行为以及寄生虫所处的发育阶段影响。因此，绵羊对于所有类型的寄生虫没有一个标准应答反应，进而使得疾病性状测量非常困难。从以往的研究来看，基于对羊肠道寄生虫分类、生活周期及摄食行为的了解，对羊抗寄生虫性状的选择主要包括三个方面[5]：寄生虫学性状（FEC、成熟幼虫数量）、免疫学性状（抗体、嗜酸性细胞、肥大细胞、白血球等）及病理学性状（血浆胃蛋白酶原浓度、红细胞压积、营养状况评分）。

3.1寄生虫学指示性状FEC

一般认为，若个体相对于同类其他个体能抑制寄生虫在体内的居留以及随后的发育增殖，则确定其有抗性。研究表明，羊粪便中的虫卵数（faecal egg count，FEC)与寄生虫载荷量有高度相关(r=0.61-0.91)，因此可被作为估计羊寄生虫抗性的主要性状[4]。截止目前，在FEC遗传特性分析等方面开展了大量研究。通过不同品种的研究表明，FEC的估计遗传力为0.22～0.43，平均约为0.3，属于中等遗传力[4]。同时，由不同寄生虫属或种引发的FEC值间的遗传相关接近0.5或更高[6]，即当羊对一种寄生虫产生抵抗力时，同时也增加了对其他寄生虫种或属的抵抗力。鉴于FEC抗寄生虫性状具有的中等遗传力，在绵羊中利用其作为选育性状通过育种措施提高内寄生虫病抗性是可能的。而在美利奴羊、Romneys羊、Perendale羊等品种内的抗性分化选育研究为提高绵羊寄生虫抗性的育种提供了实践证明[3-5]：Romneys羊选育后易感品系和抗性品系间FEC 有9.2倍的差异，Perendale羊易感和抗性品系间FEC的差异为4.9倍，美利奴羊群体中对Haemonchus contortus和Trichostrongylus两种寄生虫有高免疫反应的群体FEC降低了69%。

然而，FEC方法假设前提是虫卵数量和蠕虫数量近似地反映了寄生虫对寄主的感染程度。但寄主营养和应激状况变异、粪便中虫卵数的非均一性分布、FEC数量的非正态分布以及测量技术均可影响寄生虫和羊只间的相互作用，其结果造成FEC重复力变化[4]；其次，抗寄生虫感染的机理还不清楚，FEC抗性性状也可能与一些经济性状如羊毛、生长率、胴体品质等有拮抗作用，导致不利相关反应；最后，这种方法需花费许多人力和时间。这些不利因素限制了羊寄生虫抗病育种工作的实施。

3.2免疫学和病理学指示性状

动物对寄生虫免疫应答是一个动态过程，随品种、年龄、感染的寄生虫种类及感染后的不同时间点均有变化。一般来说，寄生虫感染后引起具抗性绵羊的局部和全身抗体、小球白细胞/粘膜肥大细胞及组织和血液循环中嗜酸细胞产量增加[7]。嗜酸性细胞可能在感染后24 h内在皱胃的隐窝包围幼虫，人工感染H. contortus后的（3～5）d组织嗜酸性细胞的数量达到最高，与幼虫占据其生活位置的时间相一致[8]，因此嗜酸细胞的数量被认为可以反映寄生虫病抗性的特征性状。免疫抗体反应研究表明，具抗性的个体不仅能产生更多IgA，而且也能产生抵抗特异性寄生虫分子的IgA，且蠕虫载荷量与局部IgA存在强的关联，所以IgA作为抗性性状可能比FEC更有用[9]。IgG对蛇形毛圆线虫的免疫反应为中等遗传力，已有利用IgGl极端高抗体水平进行育种的研究尝试，其结果说明基于这种标记进行选择具有可能性[10]。另外，血清胃泌素水平与感染后的IgA和胃蛋白酶原水平有近似的表现模式，所以其可能被作为感染的指示标记[4]。Davies等(2005)[11]报道胃蛋白酶原浓度和嗜酸性粒细胞数量等一些免疫应答或发病机制的指示性状均表现为中到高遗传力，且与FEC及蠕虫数量和产卵量呈遗传相关。另外，用红细胞积压度量的寄生虫病抗性也为中等遗传力（0.20）。

利用生理学和免疫学方法鉴别个体抗性状况有较好的适用性，并在许多情况下可进行自动操作。但其主要不足之处是动物个体需要被重复感染和重复测量，且其结果仅能在群体内进行比较。另一方面，由于寄生虫抗性生理过程的复杂性，所选用的单个或少量指示性状可能不能完全代表参与寄生虫抗性的全部途径。因此，这些方法能否替代FEC还需要进一步研究。

4　与羊寄生虫抗性相关的分子标记/候选基因鉴别

利用分子标记或候选基因作为寄生虫抗性选择标准可对动物个体进直接利用基因型进行选择。

4.1与羊寄生虫抗性相关的QTL研究

绵羊抗寄生虫病QTL分析研究在新西兰、澳大利亚、肯尼亚、美国及欧洲都有开展，且多数研究主要通过分析FEC与寄主的遗传差异以检测与抗性关联的QTL。截止目前在绵羊数量性状位点数据库中（Sheep Quantitative Trait Locus(QTL)Database，Sheep QTLdb)包含了107个与寄生虫抗性相关的QTL，这些QTL涵盖了21个与FEC相关的不同种类寄生虫抗性性状，覆盖了除5号、19号染色体外的其他全部染色体[12]。另外，对其他抗性指示性状的研究也发现相关QTL。圆线虫属寄生虫感染引发IgA产生免疫应答的QTL被定位于3号染色体和20号染色体[13]；H.contortus感染后红细胞积压的QTL位于1号染色体与FEC的QTL相同座位[5]。

多个位于不同染色体区域寄生虫抗性QTL的发现可能归因于不同研究所用的绵羊品种、针对的寄生虫种类、抗性性状选择、寄生虫感染方法和时间等的不同。然而，考虑到绵羊产生寄生虫抵抗力生理过程的复杂性，不同区域QTL可能也代表了其抗性产生的不同途径，表明寄主抵抗力不可能被单个座位控制。

在这些检测到的QTL区域，已发现一些与免疫生理功能相关的基因（组），如IFN-g、MHC、IgE等，其他利用候选基因的方法也进一步表明它们作为绵羊寄生虫抗性候选基因的可能性。羊MHC（主要组织相容性复合物，major histocompatibility complex)是多态、多基因复合体。MHC类型I和MHC类型II基因编码了将肽类结合到免疫系统T细胞以激活T细胞的结构糖蛋白，因此MHC在启动免疫应答方面有重要功能。在不同绵羊品种的MHC类型I和类型II中均检测到与寄生虫抗性间的关联的基因 （MHC I G13br，MHC DRB1 GS1等）[4,14-16]。然而，DRB1基因具高度多态的特性，目前已检测到80个等位基因，基因型几乎不可能测定，研究难度大；IFN-g有改变动物对多种感染病的抵抗力和免疫应答性的潜力，因为它是影响动物免疫状态的强的免疫效应物细胞因子，且在野羊和家养品种Soay、Romney、Merino和Texel羊中均发现其与寄生虫抗性的关联；IgE免疫球蛋白是抵抗寄生虫感染的重要的抗体，在急性过敏性反应中有主要作用。IgE基因H链恒定区的5'非翻译区的多态性已证明与美利奴羊的FEC变异关联[17]。

4.2不同寄生虫抗性基因差异表达

分析基因表达差异是筛选羊寄生虫抗性候选基因的另一个途径，目前该项技术已用于检测与羊寄生虫免疫应答相关的基因研究。Cristina Diez-Tascón等（2004）[18]研究了Perendale羊寄生虫抗性品系和易感品系肠组织基因表达差异，检测到超过100个差异表达基因。进一步的研究表明具抗性个体差异表达基因代表了两个路径：获得性免疫应答的形成和小肠平滑肌结构的发育。其中，与获得性免疫形成的特定路径相关的MHC和稳态趋化因子受体（homeostatic chemokine receptor CXCR4）在抗性个体肠组织中被上调。MHCII基因的表达差异可能证实了QTL分析结果。而CXCR4参与了许多生物学过程，也是目前的一个研究热点。最近的研究建议CXCR4运输抗原进入内吞通道传递给MHC II分子，从而有助于MHCII实施其功能。同时，具抗性个体小肠组织中两个差异表达基因与肠平滑肌的结构和功能有关。TAGLN是一个细胞骨架蛋白，其在内脏和血管平滑肌细胞中大量表达。肌动蛋白γ2（ACTG2）是一个特异的肠肌动蛋白亚型。TAGLN直接结合到肌动蛋白丝，它的功能可能是维持平滑肌细胞中肌动蛋白丝的空间关系。这两个基因的同时上调可能是具抗性羔羊增加了肠的运动性以加快排出寄生虫。Rowe等（2008）[19]利用具有依维菌素抗性（CAVR）和依维菌素敏感性（McMaster）的H.contortus的两个品系对美利奴杂种羊进行不同组合处理，采用牛Affymetrix基因芯片分析皱胃粘膜组织不同感染时间基因表达差异，结果表明：前期上调基因主要参与了感染识别和粘膜愈合等非特异反应(包括intelectin 2、trefoil factor 3、钙激活氯离子通道等)，与先天免疫有关。而后期上调基因主要是免疫球蛋白基因 （包括IgC、IgG2a、IGHE、IGHM等），与体液应答相关。MacKinnon等（2008）[7]利用对H.contortus抵抗力强的Caribbean羊和一般易感产毛羊为对象，通过采用牛cDNA微阵列技术研究了用H.contortus感染后不同品种皱胃粘膜组织和皱胃淋巴结组织的基因表达的差异，结果表明：在不同组织和感染状态下有超过60个转录本在品种间表现出差异，其中感染后3 d的Caribbean羊的免疫细胞滲透、皱胃组织修复、Th17应答及抗凝作用基因较产毛羊有较高表达。在感染后27 d组织样本中，肠运动能力、炎症细胞因子类及细胞增殖和分化的基因在Caribbean羊较高表达。并认为当感染H.contortus后Caribbean羊有较强的炎症应答，这可能促进了该品种的寄生虫抗性。

尽管已进行了一些研究，但已发现的差异表达基因数量较大，涉及的生理学途径相对较为复杂，且寄生虫抗性的免疫应答机制还没有完全阐明。这些研究结果及以后的相关研究还需借助于病理学、生理学、生物信息学及基因功能分析的原理和方法，进行进一步分析和验证。

5　结　语

由于寄生虫抗药性的增加、人们对食物安全和动物性传染病关注程度的提高以及许多社会、经济因素的压力，绵羊育种者不得不考虑借助于遗传学方法解决许多疾病的防止。目前，利用FEC值已成功育成抗性品种，依据包括QTL的育种计划增加寄生虫抵抗力也有报道。实施包含抗性QTL育种计划和证实候选基因和抗性间的关联反映了化学驱虫向育种驱虫的一大转变。是否随着寄主的遗传改变寄生虫本身也会发生应对性变化尚无报道。Bishop和Stear(2003)[20]提出一个论点，寄生虫为适应寄主的遗传改变而发生进化的可能性应该小于象化学驱虫等其他一些控制方法，因此对寄生虫抵抗力进行选育应该是一个有效和可持续的补充控制方法。提高寄生虫病抵抗力不是唯一的育种目标，绵羊有许多生产性状、品质性状及其他疾病抗性性状需要选育提高。如果寄生虫病抗性育种对其他性状有不利影响，则其结果是弊大于利。如果能将抗性育种与已有的育种方案相结合，将可能产生最好的方案。

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中图分类号：S858.26

文献标识码：A

文章编号：1003-6377（2016）03-0007-05

基金项目：新疆维吾尔自治区国际合作科技计划项目“中哈绵羊优质生产科学中心建设示范”（20156015）

作者简介：王冰（1973-），男，畜牧师，主要研究方向为绵羊育种、畜牧经济。E-mail：1512054174@qq.com

收稿日期：2016-02-15修回日期：2016-02-24

Recent Development of Study on Breeding of Sheep with Resistance to Intestinal Parasitic Disease

WANG Bing1,ZHAO Gui-ping2,GOU Xi-xun2,GAO Wei-ming3
(1.Xinjiang Animal Science Academy,Urumqi 830011,China; 2.Xinjiang Baicheng Stud Farm,Baicheng Xinjiang 842300,China; 3.Institute of Animal Science In Quality Standard of Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830011,China）

Abstract:Intestinal parasitic disease is one of the most harmful diseases that affect the development of of sheep industries.Anthelmintics play an effective role in control of parasites parasitized in sheep,but the increasing resistance to drugs and residues within animal products requests a new alternation.It is proved by a number of studies that there is difference of resistance to parasite among breeds of sheep or individuals of the same breed.It is possible for the available heritable variation to improve the resistance of sheep by breeding,and some current successful experience provides evidences to implement such method.The choice of resistance is mainly based on Faece Egg Counting（FEC），while the genetic marker with resistance will provide more effective method.Presently,many people study and devote themselves to look for molecular genetic markers related to resistance of parasite,including studies on functional genomics of gene assignment and expression that are in progress,and some genes with resistance expression difference have been found. The comprehensive studies in various fields,such as quantitative genetics,functional genomics,massive data collection,forecasting of epidemiology,will bring more opportunities to breeding of sheep with resistance to parasitic disease.

Key words:sheep;internal parasite;QTL;gene expression;breeding