骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞的研究进展*

陈得胜,林炎水

成都医学院第一附属医院 关节外科(成都 610500)

·综 述·

骨髓基质干细胞体外诱导成骨细胞的研究进展*

陈得胜,林炎水△

成都医学院第一附属医院 关节外科(成都 610500)

骨髓基质干细胞；成骨细胞；成骨诱导

大量科学研究表明，来源于中胚层的未分化的间充质细胞是骨髓非造血干细胞中的一类，这类细胞体外扩增程度高、可多个向分化、容易进行移植、可支持造血等，其独特之处为该细胞可向诸如成骨细胞、软骨细胞、脂细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞、肝细胞等多种细胞分化，所以其又被称为骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)。BMSCs是获取目标细胞、目标组织热门的种子细胞[1]。近几十年来，关于BMSCs的多向分化特性有了不断深入的研究，在探讨如何将BMSCs诱导分化为成骨细胞的方法方面做了大量的科学研究。现就BMSCs体外定向诱导成骨细胞的方法作一综述，对其研究进展作一回顾。

1 BMSCs分离培养方法

目前，BMSCs的分离与培养技术已较成熟，方法多种多样，常见的有密度梯度离心法、全骨髓培养法、流式细胞仪法和免疫磁珠分离法等，各有优缺点，可以根据实验条件和实验要求进行选择。

1.1 免疫磁珠分离和流式细胞仪分离法

采用免疫磁珠分离和流式细胞仪分离方法所获得的BMSCs纯度较高，不足在于这两种方法均使细胞的分化能力和活性减低，且对实验条件要求较高，对骨髓的要求量较大，所以不常采用。

1.2 全骨髓培养法

BMSCs有贴壁生长的特性，可以利用该特点进行全骨髓培养来分离培养细胞，该方法不会破坏BMSCs的原始生活环境，有利于细胞的生长和分化。但把造血干细胞和其他种类细胞共培养，难以避免其他杂质细胞在贴壁细胞中出现，且BMSCs和其他杂质细胞的性质差别很大，较难得到纯化的BMSCs[2]。

1.3 密度梯度离心法

密度梯度离心法使用较普遍，该方法是利用骨髓各成分间密度的差异，通过离心力的作用去除大部分的血细胞来提取BMSCs，此时的BMSCs内含有小部分造血系血细胞，有待进一步纯化，其主要利用造血系细胞和BMSCs的贴壁性能差异反复更换培养液将悬浮生长的血细胞去除，使BMSCs得到纯化。

1.4 细胞片层技术法

细胞片层技术分离培养BMSCs是一种新的方法，和传统方法相比具有独特的优势[3]。细胞贴壁培养过程中胞外的蛋白使细胞间或细胞与培养瓶内壁黏连，此时直接吹打细胞来进行传代培养难度大，吹打下来的细胞易受到严重的损害，所以传统方法用胰蛋白酶对细胞进行消化来分离和传代培养细胞。由于消化时间和消化过程难以得到精准控制，细胞外基质一定程度上受到破坏，细胞活性降低，细胞染色体突变机会增加[4]。国外研究者[5]发现一种复合物组成的培养皿具有很强的温度反应特异性，该培养皿由聚异丙基丙烯酰胺与普通聚乙烯培养皿共价结合组成，对温度和CO2饱和湿度的变化十分敏感，随着温度和CO2饱和湿度的变化，培养基表面变成亲水性或疏水性。在培养皿表现为疏水性的条件下，BMSCs可以在培养皿的表面进行附着、扩增、增殖；当培养皿表面表现为亲水性时，聚异丙基丙烯酰胺与普通聚乙烯培养皿复合物在培养皿的表面形成水化层，细胞在此时可以主动脱落形成细胞片层。该研究还指出培养皿表面表现为疏水性的条件环境温度为32 ℃、CO2饱和湿度为5%，而亲水性的条件是温度20 ℃、CO2饱和湿度为5%。有研究指出：细胞培养的效果还与细胞片层厚度相关，当厚度过薄或过厚时细胞均不会良好生长；当厚度在15～20 nm时，培养皿表面的细胞可迅速附着、扩增，超过30 nm时细胞的黏附率和增殖数目均会受到影响[6]，但最佳厚度有待进一步研究。应用细胞片层技术所获得的种子细胞进行成骨诱导时可获得类似板层状骨，通过可降解生物支架材料为载体，再通过载体的转运功能把单层或多层的BMSCs细胞片层植入受区，并对BMSCs加以成骨诱导，使其细胞-支架复合物最终形成类似于板层结构的组织工程骨，这是构建组织工程骨较好的思路[3]。

2 成骨细胞的主要标志物及检测方法

2.1 主要标志物

碱性磷酸酶(简称ALP或AKP)是广泛分布在人体肝脏、骨骼、肠、肾、胎盘等组织中的一种酶，ALP是成骨细胞所分泌的酶蛋白，目前已发现ALP有ALP1～ALP6 六种同工酶，其中第1、2、6三种来源于肝脏，第3种来源于骨细胞，第4种来源于胎盘以及癌细胞，第5种来源于小肠绒毛上皮和成纤维细胞。由于骨细胞能够分泌产生ALP，可通过对ALP活性表达的分析来判断BMSCs的成骨分化特性。

2.2 主要检测方法

碱性磷酸酶(ALP)活性测定、骨钙素分泌量测定、钙盐沉积量测定、电镜扫描、HE染色、基因表达量分析等。

3 不同诱导方法诱导BMSCs向骨细胞分化

3.1 物理因素诱导BMSCs成骨

国内研究[7]表明，恒定磁场可以促进BMSCs向成骨细胞分化，该实验通过控制变量对比分析有无恒定磁场两组的BMSCs向成骨细胞诱导分化的效果，干预条件除一组有恒定磁场干预外，其他的条件均一样，对诱导后的两组培养皿同时在不同的时间段进行ALP活性测定、细胞增殖数目、VonKossa 染色检测，MTT显示在第3天时两组培养皿内的细胞增殖有差异，恒定磁场组的细胞增殖数目和速度明显高于无恒定磁场组，差异随时间的变化更加明显，在第5、7天检测时发现所有检测项目磁场组均高于非磁场组。研究[8]表明，细胞的某些特殊结构还能被恒定磁场干预发生改变，如恒定磁场可作用于细胞的表面微细结构对细胞的排列顺序进行调整，从而加快细胞的增值分化，有利于成骨细胞成骨。国外已有研究报道，脉冲电磁场可作用于mc3t3-e1 成骨样细胞系，通过促进细胞的增殖分化来加速骨样组织的形成，但其作用机制有待进一步研究。自上世纪八十年代Haupt等报道体外冲击波成功治疗骨折不愈合1例后，国内外很多学者对其作用机制进行了大量研究。Wang等[9]发现低能冲击波可使BMSCs的细胞膜发生电势超极化，可促进BMSCs向成骨细胞方向分化，并形成骨小节。国内研究者[10]把8.5 kV 的工作电压作用于BMSCs细胞培养皿，发现脉冲有促进BMSCs成骨分化的作用，且不同频次脉冲的作用强度有差异，说明低能冲击波促进BMSCs成骨分化的作用机制与c-fos、c-jun基因表达量增加有关。

3.2 化学试剂诱导

化学试剂是在传统的BMSCs向成骨细胞分化的诱导剂中比较常见的选择，这些化学试剂可以通过MAPK信号传导途径诱导BMSCs向成骨细胞分化，如抗坏血酸、地塞米松和B-磷酸甘油等。但这些刺激因素对细胞的分化具有反向作用，如地塞米松抑制了细胞的分裂和增殖，所以种子细胞的数目很难得到满足[11]。

3.3 诱导因子诱导

3.3.1 生长因子诱导BMSCs成骨 国内有研究证明富血小板血浆对BMSCs向成骨细胞的分化有诱导作用，该作用可能与富血小板血浆内含有某种特殊的生长因子有关，其内的细胞因子能促进BMSCs的增殖与成骨分化，且PRP完全来源于自体，制作简单，无免疫排斥反应，因此在临床上具有良好的应用前景。国内研究者[12-13]利用富血小板血浆诱导BMSCs向成骨细胞分化，但PRP浓度和作用时间有待进一步研究。有研究指出不同部位和不同年龄阶段的PRP对人BMSCs的诱导作用存在一定的差异，如Murphy等[14]把成人血和脐带血制作的PRP进行对比，发现脐带血制作的PRP对BMSCs的促进作用强于成人血制作的PRP。张晔等[15]实验结果表明，富血小板血浆刺激骨细胞增殖，增强成骨活性，作用机制可能是富血小板血浆内的转化生长因子β诱发细胞内基因水平的改变，并有向cbfal基因的成骨启动基因进一步进行基因调控而增加成骨活性，加速骨的修复。除富血小板血浆内的转化生长因子有促进BMSCs向成骨细胞分化作用外，近年还发现富血小板血浆内的其他多种高浓度生长因子也有类似的功能，如血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等[16]，这些生长因子大部分具有诱导BMSCs成骨细胞分化、促进骨再生修复骨缺损的作用[17-21]，还能够诱导BMSCs向血管内皮细胞、胰岛样细胞分化。富血小板血浆内不同的生长因子具有不同的作用机制，转化生长因子β和成骨细胞相互作用，转化生长因子β可以增强BMSCs转化成成骨细胞的活性并增加其数量，通过自分泌和旁分泌刺激骨细胞形成，成骨细胞则可分泌转化生长因子β[22]。表皮生长因子既可单独作用于BMSCs，又能够与转化生长因子协同作用来刺激BMSCs的增殖和向成骨细胞分化[23]。血小板源性生长因子则通过丝裂作用促进BMSCs的增殖分化，该因子是间充质起源细胞的丝裂原，最先出现在骨折愈合过程中，可以通过刺激BMSCs的有丝分裂来增加成骨细胞的数量，促进其分泌形成胞外基[23]。近来，张巧凤等[24]利用胰岛素样生长因子-I明胶微球(IGF-I-GMs)通过缓慢释放IGF-I来促进BMSCs向成骨细胞分化，比单用IGF-I促进BMSCs向成骨细胞分化具有更好的效果。另外，骨形态发生蛋白-2尚有诱导BMSCs成骨和促进成骨因子VEGF表达的作用[25]，而血管内皮生长因子既是一种主要的血管形成因子，又是一种重要的骨生长因子。作为一种不可或缺的骨生长因子，其在成骨细胞、破骨细胞的增殖、分化及功能活性方面发挥着重要的作用，对骨质疏松的发生发展有重大影响。调控VEGF的表达可能是骨形态发生蛋白-2参与骨代谢的机制之一。

3.3.2 血管紧张素转换酶抑制剂(angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI) ACEI通过对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的干预来间接促进BMSCs向成骨细胞分化[26]。VEGF在血管生成和成骨细胞分化过程中均发挥重大作用[27-29]。报道[30-32]证实：在BMSCs向成骨细胞诱导后，VEGF的表达量显著升高，VEGF维持种子细胞的成骨表型，增加成骨细胞的数量，在促进骨组织形成的同时减少骨的吸收。ACEI通过对VEGF的干预来间接促进BMSCs向成骨细胞分化，而VEGF又能够促进BMSCs向血管内皮细胞的分化，对血管的修复与再生有一定的作用，因此应用ACEI诱导BMSCs成骨和VEGF诱导BMSCs成血管内皮细胞进行血管修复与再生或许可以解决临床缺血性骨坏死这一难题[33-34]。

3.4 基因修饰诱导BMSCs成骨

3.4.1 腺病毒和逆转录载体 除了人工基因重组方法获取bFGF、TGF-β、BMP-2、BMP-7 等生长因子外，还可以利用病毒和非病毒载体途径将这些生长因子进行体外转移，再导入BMSCs内，形成生长因子-BMSCs 复合物，对复合物进行定向诱导可以形成目标细胞来修复目标组织，如修复骨缺损。国外研究者在十几年前就做过此项实验，以腺病毒体外转移途径将BMP-2 基因导入BMSCs内，并与脱矿骨基质结合形成复合物，再将复合物植入有骨缺损的小鼠体内，2个月后观察24处骨缺损中有 22 处达到了骨性愈合[35]。国外研究者把用端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcrip tase,TERT)基因修饰的BMSCs进行体外连续传代培养，通过观察发现在3年后BMSCs仍保持良好的自我更新和多向分化潜能[36]。研究者[37]发现骨形态发生蛋白2真核表达载体在体外可以异位成骨，并能进一步促进兔桡骨缺损的修复。有学者把腺病毒途径和逆转录病毒、脂质体载体途径进行修复骨缺损效果对比，发现腺病毒途径对转hBMP-2基因小鼠BMSCs修复颅骨缺损效果最突出，而脂质体载体途径疗效最差。

3.4.2 基因转染技术 基因转染技术是通过编码特定功能因子基因并转移到种子细胞或生物活性基质材料里，转染细胞可表达目的基因及产物，进一步在体内增殖、分化，如粟谋等[38]通过PCR方法构建重组质粒pcDNA3-hNGF并转染至大鼠BMSCs中，促进BMSCs向软骨细胞或骨细胞增殖、分化来达到骨折基因治疗的目的。研究已证实多种细胞生长因子通过基因转染可以有效促进BMSCs的成骨活性，如国内研究表明bFGF、BMP基因的转染能够极明显促进BMSCs的增殖，利用VEGF基因转染技术同样可在很大程度促进BMSCs的增殖。笔者还通过ALP活性分析、骨钙素含量测定等方法比较bFGF、BMP-2、VEGF三种生长因子对BMSCs增殖的不同影响，结果BMP-2转染组ALP活性和骨钙素的含量升高最为明显[40]。TGF-β1基因转染同样可增加BMSCs的成骨活性，有研究表明将TGF-β1基因的复制缺陷型病毒转入成骨细胞后，可使细胞内的I型胶原含量明显增加。成骨细胞经TGF-β1 转染后在人体内的活性升高，新生骨的数量明显增加[41]。近期，国内研究者[42]把成纤维细胞生长因子l型受体(fibroblast growth factor receptors 1，FGFR 1)通过显性负性作用(dominant negative strategy，DN) 转染BMSCs，发现成骨细胞ALP活性显著提高，并说明BMSCs经历了由骨祖细胞到成骨前体细胞再到成骨细胞，最终凋亡(或是骨细胞、骨衬细胞)的过程。

3.5 仿生支架材料诱导

随着组织工程技术和再生医学的发展，如何获取组织工程骨修复骨缺损的研究不断深入。通常认为组织工程的三要素是种子细胞、生长因子、支架材料，在种子细胞、生长因子研究方面取得重大进步的同时，支架材料也得到迅速发展，各种支架材料应运而生，使细胞培养实现了从单悬细胞培养、多层细胞培养、三维立体细胞培养的过程。生物支架材料的功能在于为细胞提供一个三维空间，为细胞的营养获取和生长代谢提供一个良好的环境。细胞-生物支架复合物植入机体受损的组织和器官后，随着细胞的不断增值、分化，最终形成靶器官和组织，支架慢慢降解、吸收，从而达到组织修复与再生重建的目的。张开刚等[42]将小肠黏膜下层制备的支架材料与经成骨诱导剂培养的第3 代BMSCs结合，形成支架-材料复合物，并将复合物植入没有胸腺结构的裸鼠皮下继续进行培养，电镜下见有大量骨组织形成，免疫组化检测有成骨细胞生成，该细胞可以分泌特异性骨钙蛋白。许宇霞等[43]取分离培养的第3代人BMSCs接种于纳米羟基磷灰石表面，并加入含浓度为50 mg/L维生素C、10 mmol/L β甘油磷酸钠、1 mmol/L地塞米松培养基进行诱导分化培养，电镜扫描可观察到材料孔隙内有细胞长入。王桂芳等[44]应用TiO2纳米管负载聚六亚甲基胍在一定浓度下促进大鼠BMSCs的成骨性分化，并能显著提高种植体钛表面的促成骨分化能力。王闯建等[45]把I型胶原和PLGA/13-TCP复合支架组合成新的包芯结构骨支架，并在骨支架上移植、培养BMSCs，促进其向成骨细胞分化来修复兔桡骨缺损，该新支架结构显著提高了支架表面亲水性，基于I型胶原凝胶具有的半固体、半液态特点，既有效解决了接种时细胞大量丢失的问题，又实现了细胞在支架孔隙中均匀的分布。国内研究者[46]近期还利用多聚赖氨酸表面修饰的脱钙骨基质富集材料来促进人BMSCs的黏附、增殖与基质分泌等来探索临床骨修复所面临的干细胞密度低、容易流失问题，该材料与BMSCs具有良好的生物相容性、低细胞毒性，是一种简便的物理吸附方法，不影响成骨诱导后BMSCs的生长及成骨活性，有望成为临床应用自体红骨髓联合选择性细胞滞留技术治疗骨缺损、骨不连所需的优先选择富集材料之一。尉晓蔚等[47]应用国产多孔玻璃碳作骨组织工程的支架载体材料促进BMSCs的黏附和增殖，该材料无细胞毒性，打破了多孔钽金属医用材料所面临的国外垄断、造价昂贵问题，为进一步制造出国产多孔钽金属奠定前期的实验基础。

除了上述支架材料外，尚有冻干骨基质(fdDBM)、磷酸三钙(TCP)、孔径分别为200 μM及500 μM的珊瑚羟磷灰石(CH200、CH500)等，面对支架材料的多样性，组织工程应考虑：生物相容性、无细胞毒性；具有一定强度的生物力学特性，在局部环境给予种子细胞提供结构上的支持作用；生物可降解性以及吸收速率的可调性；易塑性和临床应用；合适的孔隙率和孔径大小。

3.6 其他诱导

近来，明磊国等[48]通过实验发现一定浓度的8-异戊烯基柑橘素对BMSCs向成骨分化有促进作用，但其作用机制尚不明确。Christoffel等[49]研究表明，8-异戊烯基柑橘素能够抑制骨质疏松模型大鼠的骨密度下降。Sehmisch等[50]比较研究8-异戊烯基柑橘素、6-异戊烯基柑橘素、6,8-异戊烯基柑橘素的抗骨质疏松的活性，发现8-异戊烯基柑橘素的活性最强。

4 展望

BMSCs是热门的种子细胞，不仅可向成骨细胞分化，还可向血管内皮细胞、软骨细胞等细胞分化，基于其多向分化的特性，为骨科获取复合组织工程骨提供了可能，各种原因引起的关节软骨缺损、骨缺损、缺血性骨坏死是骨科所面临的一大难题，倘若能找到一种或多种诱导条件共作用于BMSCs，诱导其同时向成骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞分化，骨缺损或缺血性骨坏死的临床治疗会出现另一个崭新的前景，有待进一步研究。

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http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161207.1046.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.06.027

四川省卫生厅科研基金资助项目(No:120483)

R329

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△通信作者：林炎水，E-mail：lys0596@163.com