鸡传染性法氏囊病与大肠杆菌病混合感染的诊断

王　亮（鹤壁市动物卫生监督所，河南鹤壁　458030）



鸡传染性法氏囊病与大肠杆菌病混合感染的诊断

王亮
（鹤壁市动物卫生监督所，河南鹤壁458030）

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病毒（IBDV）引起雏鸡的一种急性高度接触性传染病，不仅造成感染雏鸡的大批死亡，而且更重要的是IBDV可以造成免疫器官法氏囊破坏，导致免疫抑制，从而降低机体对其他疾病的抵御能力，从而极易继发大肠杆菌病和鸡新城疫等，所造成的损失往往超过该病本身造成的损失。随着养鸡规模的扩大和饲养密度的不断增加，鸡传染性法氏囊病也在一些地区鸡场中不断发生和流行，而且发病率和死亡率居高不下，给养鸡业带来重大经济损失，严重危害养鸡业发展。

大肠杆菌广泛存在于养鸡场。免疫抑制病原体感染、呼吸道损伤、饥饿或过饱、饲料配比不当或突然改变、畜禽群密度大、通风换气不良和气候剧变等均可诱发鸡大肠杆菌病，特别是免疫抑制病原体如IBDV等的感染。该病一年四季均可发生，对幼龄畜禽危害更大，可造成病鸡气囊炎、心包炎、肝周炎及输卵管炎和卵黄性腹膜炎等，随着大型集约化养殖业的发展，大肠杆菌对养鸡业造成的危害已日益明显。

根据流行病学、临床症状和尸体剖检变化，以及实验室诊断，此次疫情是由鸡传染性法氏囊病毒和大肠杆菌混合感染引起的，为及时治疗提供了前体。

1　临床诊断

1.1发病情况

最初鸡舍出现零星发病的鸡，病鸡精神沉郁，采食量减少，拉白色水样粪便。3d后，发病264只，死亡80只，发病率18.3%，病死率30.3%。

1.2临床症状

最初发现鸡群采食量减少，拉水样粪便，有些鸡啄自己的泄殖腔，病鸡越来越多，病鸡采食废绝，精神萎顿，羽毛蓬乱，呆立墙角。随即出现腹泻，排白色或黄色水样稀粪，肛门周围羽毛粘有粪污。严重病鸡头垂地，闭眼呈昏睡状态。严重脱水，极度虚弱，最后死亡。

1.3剖检变化

病死鸡腹腔有纤维素渗出物，呈灰白色，心包膜和肝被膜上附有纤维素性内膜，心包膜增厚，心包液增量，混浊；在肝表面和心外膜上有一层黄白色纤维素膜；肾脏肿大，有尿酸盐沉积而呈红白相间的“花斑”状外观；胸肌和腿肌有条状出血；法氏囊水肿和出血，体积增大，重量增加，切开后黏膜皱褶多混浊不清，囊内有少量干酪样渗出物或白色黏稠液体。

1.4临床诊断结果

根据流行病学、临床症状和尸体剖检变化，特别是胸肌和腿肌出血、法氏囊的剖检变化、拉白色或黄色水样稀粪以及心包膜和肝被膜上附有纤维素性内膜，初步诊断为鸡传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染。

2　实验室诊断

2.1传染性法氏囊病病毒的RT-PCR诊断

2.1.1RNA提取

取绿豆大小的病死鸡法氏囊组织放入灭菌研磨器，研碎，加300μl冰冷DEPC水再磨片刻，冻融3次，4℃5000 g/min离心10min，取200μl上清加入600μlRNAisoPlus，混匀后室温作用5min，加入200μl氯仿，摇匀作用1～3 min，4℃12000g离心10min。吸取上清，置于另一DEPC水处理过的eppendorf管中，按上清与异丙醇（1∶1）体积比加入异丙醇，室温作用10min，4℃12000g离心10min，吸弃上清，DEPC水配制的75%乙醇洗涤2次，干燥后25μl DEPC水溶解沉淀，-20℃保存备用。

2.1.2cDNA合成

取RNA悬液3μl与VP2保守位点上、下游引物（上游引物：ACT-GTGGGGGACACAGGGT，下游引物：CTGTCAGTTCACTCAGGCTTCC）各1μl（20pmol）混匀后置于70℃水浴中5min，冰浴10min，再依次加入5„反转录酶缓冲液4μl，0.1MDTT2μl，2.5MdNTPs4μl，RNA酶抑制剂1μl（20U），M-MLV反转录酶1μl，DEPC水补足20μl，37℃水浴中作用1.5h。95℃作用5min灭活反转录酶。

2.1.3PCR扩增

10 5BR%聚合酶缓冲液2μl、cDNA2μl，2.5mmol dNTPs1μl，10pmol上、下游引物各0.2μl，5BR%/聚合酶0.2μl后，灭菌去离子水补足20μl，反应条件是95℃3 min，94℃50s，56℃45s，72℃40s，35个循环，最后72℃延伸7min。取5μlPCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，检查扩增结果。

2.1.4RT-PCR结果

由电泳结果可知，待检法氏囊样品扩增出了约270bp的目的片段，与预期大小相符（如下图）。

2.2大肠杆菌检测

2.2.1涂片镜检

无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，革兰氏染色后镜检，可见针尖大小两端钝圆、多数散在排列的革兰氏阴性球杆菌。

2.2.2细菌分离培养

无菌采集病、死鸡的肝脏，接种麦康凯琼脂平板，37℃温箱培养24h，形成圆形、表面光滑、湿润的粉红色菌落。挑取粉红色菌落，涂片，革兰氏染色，可见均匀针尖大小革兰氏阴性球杆菌。

2.3综合诊断

根据流行病学、临床症状、病理剖检变化，及RT-PCR和细菌分离、革兰氏染色镜检结果，确诊为鸡传染性法氏囊病毒与大肠杆菌混合感染。

3　讨论

鸡传染性法氏囊病（IBD）是危害我国养鸡业发展最严重的疫病之一。准确快速的诊断对该病的控制具有积极意义，然而由于IBDV双股RNA病毒，变异较快，给RT－PCR的应用带来不便，研究选取IBDVVP2基因保守位点设计引物，则有效克服了这一问题。

大肠杆菌是一种条件性致病菌，当机体受到应激或其他病原体感染而免疫力下降时，就大量繁殖，引起发病。该起疫情就是由鸡传染性法氏囊病病毒首先感染，鸡体免疫力下降后，继发感染大肠杆菌引起的，这与鸡群发病突然，病死率高相一致。

近年来，在养鸡实践中，多病原的多重感染或混合感染己是普遍发病的规律。鸡群中发病，常常不是某单一的病原体引起，而是两种以上的病原体共同作用造成的，即常称的共感染，其结果造成病鸡的高发病率和高死亡率，诊断和防治难度加大，造成巨大的经济损失。该起疫情就是由鸡传染性法氏囊病毒与大肠杆菌共同作用的结果。对这类疾病的诊断仅靠临诊症状和剖检变化，没法做出准确诊断。因此，只有通过发病鸡的流行病学、临诊症状和病理变化及实验室诊断，才能够做出准确的诊断，避免盲目采取措施，造成更大损失。

收稿日期：（2015-12-26）

中图分类号：S858.31

文献标识码：

文章编号：1004-5090（2016）02-0043-02