瓜蒌散对奶牛临床型乳房炎临床疗效评价

于文会，王　丽，刘　旭，姜　龙，陈亚楠，王珵珵，张柏林（.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨　50030；.巴吉垒镇畜牧兽医站，吉林　农安　3000）



瓜蒌散对奶牛临床型乳房炎临床疗效评价

于文会1，王丽1，刘旭1，姜龙1，陈亚楠1，王珵珵1，张柏林2
（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030；2.巴吉垒镇畜牧兽医站，吉林农安130200）

摘要：为评价瓜蒌散对临床性乳房炎治疗效果，将患临床型乳房炎奶牛分为西药治疗组和中药治疗组，同时以乳房炎阴性健康奶牛作空白对照。各组分别在0、5、10、15 d采集样品。统计中药组、西药组治愈头数及有效头数；测定乳汁中体细胞数；乳清中SA、ALT、AST、LDH含量；检测各组淋巴细胞刺激指数和嗜中性粒细胞吞噬率。试验结果显示，中药组治愈率为57.1%、有效率为92.9%，西药组治愈率为23.1%，有效率为69.2%；给药15 d后，中药治疗组乳汁中SCC低于西药组（P<0.01）；西药组淋巴刺激指数低于健康组（P<0.05）；西药组嗜中性粒细胞吞噬率低于健康组（P<0.05），中药治疗组与健康组比较无显著差异（P>0.05）；中药治疗组SA、ALT、AST、LDH低于对照组（P<0.01）。结果表明，瓜蒌散具有加速受损乳腺组织修复作用，对奶牛临床型乳房炎治疗效果显著。

关键词：奶牛；临床型乳房炎；瓜蒌散；疗效

于文会,王丽,刘旭,等.瓜蒌散对奶牛临床型乳房炎临床疗效评价[J].东北农业大学学报, 2016, 47(2): 40-45.

Yu Wenhui, Wang Li, Liu Xu, et al. Effect of treatment on Gua-Lou San for clinical cow mastitis[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(2): 40-45. (in Chinese with English abstract)

乳房炎是制约奶牛养殖的常发病和多发病之一，可引起奶牛产奶量降低，乳品品质改变，甚至泌乳机能丧失，母牛过早淘汰等问题[1-2]。乳房炎主要致病因素是病原微生物，引起乳房感染的致病菌有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、乳链球菌、牛链球菌、粪链球菌、大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、沙门菌属、肠杆菌属、志贺菌属、棒状杆菌属、酵母菌等[3-6]。大肠埃希菌和金黄葡萄球菌被视为乳房炎主要致病菌[7-9]。我国奶牛养殖分布广泛，不同地区或养殖场乳房炎致病菌不同，刘红从临床型乳房炎乳汁中分离到金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌和化脓链球菌[10]；王娜等从隐性乳房炎乳汁中分离到金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、无乳链球菌、乳房链球菌、化脓链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、柠檬酸盐杆菌[11]。Ying等研究表明支原体、真菌、病毒及寄生虫等致病原也可引起乳房炎[12]。长期以来，乳房炎的治疗主要依赖抗菌素等化学类药品，由于抗菌素不规范使用，造成多种抗药菌株产生[13]，致使治疗乳房炎抗菌素用量不断加大，乳品中抗菌素残留[14]，对环境和人类健康构成威胁，寻找替代抗菌素新疗法已成为乳房炎防治热点问题。中药防治同抗菌素相比具有不产生耐药菌株和在肉食品中无残留等优点，但中药疗法一般见效较慢，用药时间较长。本试验依据中兽医学理论，针对临床型乳房炎发病机制，结合多年中药防治乳房炎经验，选取瓜蒌、当归、贝母、乳香、没药、紫花地、蒲公英、天花粉、木香、甘草等中药组成瓜蒌散，通过检测乳汁中体细胞、机体免疫指标及乳清生化指标等评价其临床疗效，为中药在防治奶牛乳房炎中的应用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

试验奶牛来自江苏省徐州市丰县某大型牧场。

瓜蒌散由瓜蒌、当归、贝母、乳香、没药、紫花地丁、蒲公英、天花粉、木香、甘草等中药组成，均购自哈尔滨市哈东站药材市场，粉碎后过80目筛。

1.2试验分组与给药方法

将检测出的急性临床型乳房炎奶牛20头，根据乳汁状态和乳房肿胀判定等级随机分为两个试验组，西药治疗组10头（13个乳区），用400万单位青霉素+200万单位链霉素+50 mL盐水乳房灌注，每天2次，每次给药前挤净乳区乳汁，若乳汁中乳凝块较多，需用2%苏打水冲洗，外周用酒精棉消毒后再灌注药物，投药后托起乳房，上下轻揉2~3 min，利于药液扩散和乳头管闭合。

中药治疗组10头（14个乳区），将瓜蒌散煮沸15 min，候温灌服，每头每天1剂。每天两次挤净乳区乳汁。

给药15 d，同时挑选出10头完全健康牛为阴性对照组，不用药。

1.3临床型乳房炎的检测及判断标准

根据乳房肿胀、硬度、疼痛、变形等将乳房炎分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级；根据乳汁性状将乳汁分为1、2、3、4级（见表1）。根据乳汁性状分级和乳房症状分级判定乳房炎严重程度（见表2）。以表1、2为参考检查牛群，记录发病乳区乳汁状态和乳房肿胀情况，选定试验牛。疗效判定标准：转为阴性者为治愈；重度或中度转为轻度为有效；治疗后症状无明显改善视为无效。

1.4样品采集与处理

试验于第0、5、10和15天采集乳样。采样前用干净毛巾擦拭干净乳头，乳头保护剂药浴，待干，弃去前3把奶，无菌采样于50 mL灭菌离心管内，做好标记，4℃运回东北农业大学中兽医学实验室处理。15 mL用于分离乳清，分装后置于-80℃保存，1个月内检测完毕。15 mL用于体细胞检测。每次采乳样的同时从颈静脉采血10 mL，肝素抗凝（20 μg·mL-1血）。

表1乳汁状态和乳房肿胀情况分类依据Table 1 Milk status and the classification basis of breast swelling

表2临床型乳房炎判定标准Table 2 Diagnostic criteria of clinical mastitis

1.5体细胞数检测

取乳汁5 mL，在4 h内用乳汁体细胞计数仪测定体细胞数。

1.6淋巴细胞刺激指数测定

将外周血分离淋巴细胞用96孔细胞培养板培养，每孔加入100 μL（细胞含量为1×107个·mL-1）细胞悬液，加入刀豆蛋白ConA（终浓度为45 μg·mL-1）或脂多糖LPS（终浓度为10 μg·mL-1），再用RPMI-1640完全培养液调整培养体系为200 μL。每样3次重复。置5% CO2，37℃培养68 h，每孔加入5 mg MTT溶液10 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入100 μL 10% SDS-0.04 mol·L-1HCl溶液，继续培养2 h，使紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm波长下测定OD值。淋巴细胞转化率以刺激指数（SI）表示：SI =丝裂原刺激孔OD570 nm/对照孔OD570 nm。

1.7嗜中性粒细胞吞噬力测定

取2 mL抗凝血加入到2 mL淋巴细胞分离液中，离心使细胞分层。取粒细胞层0.5 mL，加入白色葡萄球菌液0.1 mL，摇匀，37℃孵育40 min，每隔10 min震荡一次，取上清液推片，姬姆萨染色，油镜下计数100个中性粒细胞，计算吞噬率：

吞噬率（%）=吞噬的中性粒细胞数/（吞噬的中性粒细胞数+未吞噬的中性粒细胞数）×100%

1.8乳清中白蛋白SA、ALT、AST、LDH测定

将乳样于4℃、4 500 r·min-1离心15 min除去乳脂，将下层液体吸出转移到另一离心管。将脱脂乳用1 mmol·L-1盐酸调节pH 4.6，将调好pH乳样于4℃、12 000 r·min-1离心30 min，将上清转移到另一离心管。用1 mmol·L-1NaOH调pH至6.8，将调好pH乳清于4℃、12 000 r·min-1离心30 min，取上清液分装后置于-20℃保存。半自动生化分析仪测定SA、ALT、AST和LDH含量，按试剂盒说明书步骤测定。

1.9数据统计分析

应用SPSS17.0软件，对组间数据进行单因素方差分析，LSD法多重比较。采用Microsoft Excel 2007软件作图。试验数据以均值±标准差（Xˉ±S）表示。P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1临床型乳房炎治疗效果

由表3可知，中药治疗组治愈头数和治愈率大于西药组，且西药组在10~15 d时有1头复发。表明利用中药治疗奶牛急性乳房炎好于西药，主要与该场治疗奶牛乳房炎长期使用抗菌素，与致病菌对抗菌素产生抗药性有关。

2.2临床型乳房炎体细胞数（SCC）测定

体细胞清除主要依靠机体自身免疫机能，由表4可知，西药组与健康组比较差异极显著（P< 0.01），5 d时中药治疗组SCC显著低于西药组（P< 0.05），10 d后极显著降低（P<0.01）。试验结果表明，中药优于西药。表明瓜蒌散中中药成分可提高机体免疫功能，增强吞噬细胞清除体细胞能力。

2.3临床型乳房炎淋巴细胞刺激指数变化

T淋巴细胞和中性粒细胞的活性，在一定程度上反映细胞免疫强弱，由表5可知，健康组淋巴细胞刺激指数高于临床型乳房炎西药组和中药组。0~ 10 d时，西药组刺激指数极显著低于健康组（P< 0.01），第15天时，显著低于健康组（P<0.05）。中药组在10 d以后，与健康组比较无显著差异（P> 0.05）。结果表明，患乳房炎奶牛淋巴细胞刺激指数极显著低于健康奶牛，说明瓜蒌散中中药成分在临床型乳房炎治疗中可显著提高淋巴细胞刺激指数，增强免疫功能。

2.4临床型乳房炎嗜中性粒细胞吞噬率变化

嗜中性粒细胞吞噬功能强弱代表机体清除致病菌能力，由表6可知，0~5 d时，西药组和中药组嗜中性粒细胞吞噬率极显著低于健康组（P<0.01）；第10天时，西药组显著低于健康组（P<0.05），中药治疗组与健康组比较无显著差异（P>0.05）；15 d时，各组无显著差异。表明，瓜蒌散中中药成分可激活嗜中性粒细胞的活性，提高其吞噬功能。

2.5临床型乳房炎乳清中ALT、AST、LDH、SA测定

临床型乳房炎乳清中ALT、AST、LDH、SA的变化趋势基本一致，由表7可知，西药组0~15 d时极显著高于健康组（P<0.01），但有逐渐降低趋势。中药治疗组在5~10 d时，基本显著低于西药组（P< 0.05）；在第15天时，极显著低于对照组（P< 0.01），与健康组无明显差异（P>0.05）。乳汁中上述生化指标含量变化间接反映瓜蒌散治疗奶牛乳房炎时，加速受损乳腺组织的修复。

表3临床型乳房炎治疗头数Table 3 Cure number of clinical mastitis cows

表4临床型乳房炎SCC变化Table 4 Changes of clinical mastitis SCC　(万个·mL-1)

表5临床型乳房炎淋巴细胞刺激指数Table 5 Clinical mastitis lymphocyte stimulation index　(%)

表6临床型乳房炎嗜中性粒细胞吞噬率Table 6 Clinical mastitis neutrophils phagocytic rate　(%)

表7临床型乳房炎乳清中ALT、AST、LDH、SA测定Table 7 Determination of ALT, AST, LDH, SA level in the clinical mastitis serum　(U·L-1)

3讨论与结论

T淋巴细胞和中性粒细胞活性，在一定程度上反映细胞免疫能力。本研究发现，患乳房炎奶牛的淋巴细胞刺激指数和嗜中性粒细胞的吞噬率均极显著低于健康奶牛，表明瓜蒌散通过提高淋巴细胞刺激指数和嗜中性粒细胞吞噬率，可增强免疫功能，治疗临床型乳房炎。陈福星研究表明瓜蒌散中蒲公英含有丰富糖类、酚酸类及黄酮类生物活性物质，有利于增强机体免疫机能[15]；柳钟勋研究表明当归及其提取物能激活T、B淋巴细胞功能，对单核吞噬细胞系统功能有显著刺激作用，提高体液免疫和非特异性免疫功能[16]；李金艳研究表明高浓度紫花地丁水煎剂能调节免疫细胞功能，减少巨噬细胞炎症介质释放，对机体非特异性免疫功能有增强作用[17]。

牛乳汁中体细胞主要包括白细胞（嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等）和受损脱落的乳腺上皮细胞，体细胞检测是目前乳房炎常用的诊断方法，Eyassu等研究表明，当乳房发生炎症时，乳中SCC升高，SCC与奶牛乳房炎严重程度成正相关，乳房炎增强乳汁中酶生物活性，活性随SCC增加而升高[18]。本试验结果表明，虽然经过15 d中药治疗组和西药组SCC数均明显降低，但中药组比西药组降低更明显，与西药组相比差异极显著（P< 0.01）。药方中的蒲公英具有清热解毒功效，通过消炎降低体细胞，与李晓翠研究蒲公英治疗奶牛乳房炎能够降低乳汁中体细胞报道一致[19]。

杨德英研究表明，患乳房炎奶牛乳汁中SA、ALT、AST、LDH升高，主要是由泌乳组织损伤引起，因此，乳汁中上述生化指标含量变化可间接反映奶牛乳房炎发生和受损乳腺组织修复情况，其中乳汁中LDH可作为乳房炎早期临床诊断特征性指标[20]。本试验结果表明，患乳房炎奶牛乳清中白蛋白（SA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）均呈增加趋势，经过15 d治疗，中药治疗组SA、ALT、AST、LDH低于西药治疗组，且二者之间差异显著（P< 0.05）。表明瓜蒌散用于治疗临床型乳房炎，不仅具有抗菌消炎作用，还有加速受损乳腺组织血液循环[21]，提高血液供应量，促进受损乳腺组织修复等作用。

瓜蒌散对奶牛临床型乳房炎治疗中表现出良好的治疗效果和应用价值，但因口服给药和治疗时间较长（一般需要15 d以上），影响推广与应用，这将成为后续深入研究内容。

[参考文献]

[ 1 ] Charls N, Dobbins J R. Mastitis losses[J]. J Am Vet Med Assoc, 1997,170: 1129-1132.

[ 2 ] JoseA, Aldo C A, Horaco R, et al. Field trials of a vaccine against bovine mastitisl: evaluation in heifers[J]. J Dairy Sci, 1997(80): 845-853.

[ 3 ]卜仁金.奶牛乳房炎的抗菌药物防治[J].兽药与饲料添加剂, 1999(3): 14-16.

[ 4 ] Heringstad B, Klemetsdal G, Ruane J. Clinical mastitis in norwegian cattle: Frequency, variance components, and genetic correlation with protein yield[J]. Livest Prod Sci, 2000, 64: 95-106.

[ 5 ]袁永隆.中国奶牛业五十年[M].北京:海洋出版社, 2000.

[ 6 ]李桐,刘鑫,张裕琪,等.包头地区临床型奶牛乳腺炎病原菌的分离与鉴定[J].动物医学进展, 2009, 30(7): 115-119.

[ 7 ] Blum S, Heller E D, Krifucks O, et al. Identification of a bovine mastitis Escherichia colisubset Leitner[J]. Vet Microbiol, 2008, 132: 135-148.

[ 8 ] Banur Boynukara T, Gulhan T, Alisarli M, et al. Classical enterotoxigenic characteristics of Staphylococcus aureusstrains isolated from bovine subclinical mastitis in Van[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 125: 209-211.

[ 9 ] Leitner G, Lubashevsky E, Training Z. Staphylococcus aureusvaccine against mastitis in dairy cows, composition and evaluation of its immunogenicity in a mouse model[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2003, 93: 159-167.

[10]刘红,高学军,车有权,等.临床型奶牛乳腺炎致病菌分析及药敏试验[J].东北农业大学学报, 2010, 41(2): 106-111.

[11]王娜,高学军.哈尔滨地区奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定[J].东北农业大学学报, 2011, 42(2): 29-32.

[12] Ying K, Kaori T, Synnott A J, et al. Characterization of bacterial population of raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCR-DGGE method[J]. Biochem Engin J, 2009, 45: 76-81.

[13]王正兵,严作廷,罗金印,等.我国奶牛乳房炎常见病原菌的耐药性检测[J].贵州农业科学, 2011, 39(4): 139-141.

[14]房亮,管春梅.朝阳市奶源户鲜牛奶中抗生素残留调查分析[J].中国卫生检验杂志, 2008, 18(8): 1613-1614.

[15]陈福星,陈文英,钟秀会.蒲公英多糖对小鼠免疫机能的影响[J].中国兽医杂志, 2009, 45(3): 19-21.

[16]柳钟勋,左增艳.当归的免疫药理作用研究[J].中国中西医结合杂志, 1992, 12(6): 378-380.

[17]李金艳,伟忠民.中药紫花地丁的研究进展[J].中国现代中药, 2008, 10(1): 27-30.

[18] Eyassu S, Dokin E F, Elna M, et al. Potential of lactoperoxidase to diagnose subclinical mastitis in goats[J]. Small Rum Res, 2007, 69 (1-3): 154-158.

[19]李晓翠,陈良雷,李波涛.蒲公英超微粉治疗奶牛隐性乳房炎的研究应用[J].中国奶牛, 2015(8): 36-38.

[20]杨德英,曹随忠,余树民,等.乳酶LDH作为奶牛隐性乳房炎早期诊断指标的研究[J].中国兽医学报, 2009, 29(6): 761-763.

[21]郭梦尧,王洪海,王国卿,等.奶牛乳房炎的病理机制及中药防治研究进展[J].动物医学进展, 2010, 31(10): 92-95.

Effect of treatment on Gua-Lou San for clinical cow mastitis

YU Wenhui1, WANG Li1, LIU Xu1, JIANG Long1, CHEN Yanan1, WANG Chengcheng1, ZHANG Bailin2(1. School of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station, Ba Jilei, Nong'an Jilin 130200, China)

Abstract:To evaluate the treatment effect of the Gua-Lou San for clinical mastitis, clinical mastitis cows were divided into western medicine group and Chinese medicine treatment group, meantime mastitis negative heal cows as the control group. Each group sampling at 0, 5, 10, 15 d. The number of cure heads and effective heads in the Chinese medicine group and western medicine group were recorded. The number of SCC, SA, ALT, AST, LDH, lymphocyte stimulation index and neutrophil phagocytic rate were determined after each sampling. The results showed that the cure rate of Chinese medicine group was 57.1% and the effective rate was 92.9%.The cure rate of the western medicine group was 23.1% and the effective rate was 69.2%. At 15 d after drug delivering, the Chinese medicine group SCC significantly lower than the western medicine group (P<0.01); the lymphocyte stimulus index of the western medicine group was lower than the healthy group (P<0.05); the phagocytic rate of neutrophils in the western medicine group was significantly lower than that in the healthy group (P< 0.05) while there was no significant difference between Chinese medicine treatment group and healthybook=41,ebook=46group (P>0.05); the SA, ALT, AST, LDH concentration of the treatment group was extremely significant lower than the control group (P<0.01). Results indicated that: the Guo-Lou San had the function of accelerating repair the damaged breast tissue,soithad shown a definite effect in the treatment of clinical cow mastitis.

Key words:cows; the clinical cow mastitis; Gua-Lou San; the curative effect

作者简介：于文会（1970-），男，教授，博士，研究方向为中兽医药在畜禽疾病防治中的应用。E-mail: yuwenhui@neau. edu. cn

基金项目：农业部公益性行业（农业）科研专项（201403051）

收稿日期：2015-08-08

中图分类号：S154.1；S567.5+1

文献标志码：A

文章编号：1005-9369（2016）02-0040-06