草莓种子萌发成苗及高效离体再生体系的建立

李文砚，孔方南，韦 优，赵 静，徐冬英，马仙花，周 婧

(广西南亚热带农业科学研究所，广西 龙州 532415)

草莓种子萌发成苗及高效离体再生体系的建立

李文砚，孔方南，韦 优，赵 静，徐冬英，马仙花，周 婧*

(广西南亚热带农业科学研究所，广西 龙州 532415)

通过研究不同培养方式对森林草莓种子萌发成苗的影响及不同基因型“Ruegen”(RE)和“Yellow Wonder”(YW)、不同外植体类型对离体再生频率的影响；另以八倍体凤梨草莓优系及2个凤梨草莓杂交组合种子建立试管苗无性系为试材，同等培养条件下进行叶片离体再生，比较离体再生能力，以筛选离体再生能力高于“全明星”的基因型，优化草莓离体再生体系。结果表明，在相同的水培条件下，RE发芽率高于YW，但两者后期成苗速度和成苗质量均差异不显著。叶片的离体再生效率和再生芽数显著高于叶柄。两种基因型RE和YW在相同类型外植体上，其再生效率差异不显著。筛选出5个11-3-2、11-4-2、YA-1、SB-8和SB-9等5个凤梨草莓基因型的再生能力比均显著高于离体再生能力高的基因型“全明星”品种，且叶片正面接触培养基的外植体不定芽再生率和平均再生芽数均高于背面接触培养基的外植体。

草莓；种子萌发；离体再生；高效；体系建立

草莓属于蔷薇科草莓属，因其果实味道酸甜、香气浓郁和颜色艳丽而深受广大消费者的喜爱[1]，具有较高的营养和经济价值。全世界范围内草莓属植物分布较为广泛，包括不同倍性的草莓属约50 个种，20 个常见种，我国有着丰富野生草莓资源，约7～9 个种[2]，在世界上属于野生草莓种质资源最丰富的国家之一[3-4]。

由于草莓的高杂合性和多倍性等特点，其新品种培育存在培育周期长、效率低下、工作量加大等问题[5]，生产上也仍缺乏抗病虫、抗逆境等的优良品种。国内外针对草莓相继开展转基因研究的时间是在20世纪80年代末[6-12]。James等[13]获得的第一株草莓转基因植株标志草莓基因工程真正开始，随着研究的不断深入，多种有价值的外源目的基因相继被转入草莓中。基因型是影响草莓遗传转化是否成功的关键，广泛收集草莓品种的不同基因型，探索更有利于草莓遗传转化的再生条件仍是目前研究热点[14]。近些年来草莓已经成为蔷薇科果树分子生物学研究的模式植物。建立高效的再生体系是遗传转化体系的基础，而高效的遗传转化体系是基因功能验证的基础。因此，以二倍体森林草莓(F.vesca)和八倍体凤梨草莓(F.×ananassa)为试材，筛选离体再生能力强且对农杆菌敏感的基因型，可为草莓功能基因验证提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试二倍体森林草莓资源RE和YW的自交种子由于沈阳农业大学果树分子生物学实验室提供。用于建立试管苗无性系的八倍体凤梨草莓共有2个杂交组合，分别为：SB(甜查理×红颜)、YA(艳丽×甘王)。凤梨草莓品种“全明星”和优系试管苗由沈阳农业大学细胞工程实验室提供。培养基的配方均由本研究团队提供。

1.2 森林草莓种子灭菌处理及培养方法

在超净工作台上将保存的草莓种子在75 %酒精中浸泡10 s，用无菌水冲洗1次，用灭菌后的滤纸吸干水分后转入0.1 %的HgCl2中消毒8 min，然后用无菌水冲洗1次，静置30 min后再用无菌水冲洗3次，每次30 s，最后将种子接种到已灭菌的培养皿中。

森林草莓种子培养方式有3种处理：①无菌水培养：用报纸将滤纸包好后在121 ℃下灭菌1 h，铺2 张于培养皿内，用无菌水润湿后接种，最后用封口膜把培养皿封上。每个基因型共接种120粒种子，平均分装在2个培养皿中。无菌水培养21 d 后转移至无激素固体培养基中培养。②无激素固体培养基培养：将种子接种到该培养基上，培养基成分为：1/2 MS(蔗糖不减半)，每个培养皿装有约25 mL 培养基。③有激素固体培养基培养，培养基成分为：MS+0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1GA3+0.02 mg·L-1IBA。每种方式每个资源各接种120 粒种子，平均分装在2个培养皿中。然后室温培养。

本试验研究了相同无菌水培养条件下不同的滤纸层厚度(2、3、4和5层)对RE和YW种子萌发的影响，每个处理分别接种30粒种子，培养7和21 d后分别观察RE和YW发芽率。

经过低温处理后的凤梨草莓杂交种子首先在清水中浸种24 h，种子表面消毒后用锋利的手术刀片切去部分种皮[15]，然后接种在无激素1/2 MS固体培养基上进行培养，每个组合各接种约150粒种子。7～14 d出芽后转移至分化培养基 (MS+0.5 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1GA3)上培养。之后再转移至继代培养基(MS+0.2 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1GA3+0.02 mg·L-1IBA)中培养。

1.3 草莓离体再生试验方法

1.3.1 森林草莓离体再生试验 外植体类型比较研究。以森林草莓RE为试材，在同一种再生培养基(MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1IBA)、同样培养条件下分析比较了叶片和叶柄的离体再生效率，不同类型外植体分别接2个培养皿，每个培养皿接种30个外植体，接种后8周调查再生率和平均再生芽数。

基因型比较研究。以2个基因型RE和YW为试材，在同一种再生培养基(MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1IBA)、同样培养条件下分析比较了叶片和叶柄的离体再生效率，接种后8周调查再生率和平均再生芽数。

1.3.2 具有高离体再生能力的八倍体凤梨草莓基因型的筛选 凤梨草莓优系叶片离体再生能力的比较研究。以实验室保存的凤梨草莓品种/优系为试材，在同一种再生培养基(MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1IBA)、同样培养条件下进行叶片离体再生培养，每份试材各接种60个外植体，平均分装在2个培养皿中。接种8周后调查再生率和平均再生芽数。

凤梨草莓试管苗无性系叶片离体再生能力的比较研究。以2个凤梨草莓杂交组合种子为试材，首先在无激素的固体培养基上培养，7～14 d后将萌发的小苗转移至分化培养基上培养。2周后从每个杂交组合中挑选9株生长健壮的单株，建立试管苗无性系。再以建立的凤梨草莓无性系为试材，在同一种再生培养基(MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1IBA)、同样培养条件下进行叶片离体再生培养，每份试材接种60个外植体，平均分装在2个培养皿中。接种8周后调查再生率和平均再生芽数。

不同凤梨草莓基因型叶片离体再生能力的比较研究。将筛选出的具有高离体再生能力的凤梨草莓基因型与凤梨草莓品种“全明星”(CK)进行对比分析离体再生能力。

1.3.3 不同放置方式对叶片离体再生能力的比较研究 以凤梨草莓为试材，在同一种再生培养基(MS+2.0 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1IBA)、同样培养条件下，分别采取叶片正面接触培养基和叶片背面接触培养基两种方式培养。每种放置方式各接种60个外植体，平均分装在2个培养皿中。接种8周后调查再生率和平均再生芽数。

1.4 数据统计及计算方法

种子发芽率( %)=发芽种子粒数/培养种子总粒数×100

离体再生试验中外植体转入草莓再生培养基8周后调查再生芽状况，统计高度在 2 mm以上的再生芽，并计算再生效率和平均再生芽数。

再生效率( %)=再生芽的外植体数/调查外植体数×100

平均再生芽数=再生芽总数/再生芽的外植体数

分化率( %)= 出芽的外植体数/接种外植体数×100

试验数据采用 SPSS 17.0 等软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 二倍体森林草莓离体再生体系的建立

2.1.1 不同因素对二倍体森林草莓种子萌发成苗的影响 培养方式和基因型对种子发芽成苗的影响。选取成熟饱满的二倍体森林草莓RE和YW的种子，消毒后分别进行无菌水培养、无激素固体培养基培养和有激素固体培养基。接种7 d后，在无菌水上培养的种子首先发芽，培养21 d 后，RE种子的发芽率为76.7 %，YW的发芽率为70.0 %；在无激素培养基上的种子发芽较慢，培养21 d后，RE种子的发芽率为36.7 %，YW的发芽率为33.3 %；在有激素培养基上培养的种子发芽最慢，萌发所需时间21 d以上，RE种子的发芽率为10.0 %，YW的发芽率为8.3 %，与其他2种培养方式相比其发芽率较低，幼苗成苗速度也较缓慢(图1)，根据上述试验内容得出，无论无菌水培养还是固体培养基培养，两种基因型RE和YW之间的种子发芽率差异均不显著(P>0.05，下同)。

滤纸层厚度对森林草莓种子萌发成苗的影响。

a:无菌水培养; b:无激素固体培养基中培养; c:添加激素固体培养基中培养图1 培养方式对森林草莓种子萌发成苗的影响Fig.1 Effect of cultivition methods on F. vesca seeds germination

基因型Genotype滤纸层数Layernumberoffilterpaper发芽率(%)Germinationrate7d21dRE213.3a76.7a310.0a80.0a43.3c63.3b50d46.7cYW26.7b70.0ab36.7b66.7ab43.3c50.0c50d53.3c

注：同列数据后不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05)，下同。

Note:The different small letters within the same column mean significant difference(P<0.05). The same as below.

图2 凤梨草莓部分优系叶片离体再生能力的比较Fig.2 In vitro adventitious buds regeneration from leaves of good strains of F. ×ananassa

基因型Genotypes再生效率(%)Regenerationrate平均再生芽数No.ofregeneratebudsperexplant再生芽玻璃化率(%)Regenerationbudvitrificationrate08-4-291.7a5.5bc011-2-135.0c3.7c1.811-2-225.0c2.8c011-2-328.3c3.2c011-2-723.3c4.1c011-3-150.0bc4.1c2.011-3-2100.0a11.4a011-4-163.3b2.3c011-4-293.3a11.5a3.711-4-355.0bc3.0c011-4-755.0bc4.7bc011-4-930.0c1.0c011-4-1066.7b2.9c011-5-235.0c4.0c0

续表2 Continued table 2

基因型Genotypes再生效率(%)Regenerationrate平均再生芽数No.ofregeneratebudsperexplant再生芽玻璃化率(%)Regenerationbudvitrificationrate11-5-1351.6bc3.0c2.911-5-1430.0c3.1c1.911-6-40c0c011-8-965.0b5.1bc011-8-1641.7bc4.7bc011-8-1768.3b1.1c011-9-338.3c1.4c011-9-661.6b3.4c2.611-9-1363.3b1.0c2.111-9-1671.7b4.4c011-9-2371.7b5.3bc011-9-2690.3a7.3b011-9-2861.6b2.1c011-9-2966.7b5.0bc011-10-30c0c011-10-90c0c0

从表1可以看出，7 d时，RE和YE种子萌发率均随着滤纸层数增加呈减少趋势，其中2和3层滤纸的发芽率之间差异均不显著，且均显著高于4和5层的萌发率(P<0.05，下同)，两者在5层滤纸下，萌发率均为0。21 d时，滤纸层厚度为2和3层的RE和YW的种子发芽率均显著高于滤纸层厚度为4和5层的种子发芽率，其中2和3层滤纸的发芽率之间差异均不显著。

表3 不同基因型再生效率比较

表4 5种基因型与“全明星”再生效率比较

表5 凤梨草莓外植体不同放置方式再生效率的比较

2.1.2 外植体类型和基因型对森林草莓离体再生效率的影响 外植体类型对RE离体再生效率的影响。试验结果表明，RE叶柄和叶片的再生频率分别为58.3和85.0；叶柄和叶片的平均再生芽数分别为4.8和7.4。RE叶片的再生频率和平均再生芽数均显著高于叶柄。

基因型对森林草莓叶片离体再生效率的影响。RE和YW叶片的离体再生频率分别为85.0 %和88.3 %；平均再生芽数分别为7.4和7.0。RE和YW两者之间的离体再生频率、平均再生芽数指标差异均不显著。

2.2 具有高离体再生能力的八倍体凤梨草莓基因型的筛选

2.2.1 凤梨草莓优系叶片离体再生能力的比较 从图2和表2可以看出，11-3-2和11-4-2再生率分别高达100.0 %和93.3 %，均显著高于除08-4-2和11-9-26之外的其它基因型；11-3-2和11-4-2平均再生芽数分别为11.4和11.5，均显著高于其它基因型；11-3-2和11-4-2的再生芽的玻璃化率为0 %或较低。因此，筛选出的2个具有高再生效率的基因型为11-3-2、11-4-2。

2.2.2 凤梨草莓杂交组合实生苗的建立及其叶片离体再生能力比较 从表3可以看出，YA-1、SB-8和SB-9再生效率均为100.0 %，均显著高于除YA-4、YA-9和SB-7之外的其他基因型；YA-1、SB-8和SB-9平均再生芽数分别为11.5、13.5和13.3，均显著高于其他基因型。因此，筛选出的3个具有高再生效率的基因型为YA-1、SB-8和SB-9。

2.2.3 不同凤梨草莓基因型叶片离体再生能力比较 从表3可以看出，筛选出的基因型除11-4-2的不定芽再生效率为93.3 %外，其他基因型11-3-2、YA-1、SB-8和SB-9的再生效率均为100.0 %，均显著高于再生效率80.0 %的对比品种“全明星”；11-3-2、11-4-2、YA-1、SB-8和SB-9平均再生芽数分别为11.4、11.5、11.5、13.5和13.3，均显著高于平均再生芽数为4.7的“全明星”。因此，共筛选出的5个具有更高再生效率的基因型为11-3-2、11-4-2、YA-1、SB-8和SB-9。

2.3 外植体的放置方式对叶片离体再生效率的影响

从表5可以看出，不同基因型，其叶片正面接触培养基的处理的离体再生效率均高达100 %，平均再生芽数10.0以上，而2种基因型的叶片背面接触培养基的处理的离体再生效率平均小于80 %，平均再生芽数7.0以下。

3 讨 论

3.1 外植体放置方式对不定芽再生的影响

接种时外植体的放置方式等因素影响叶片的生理状态，而叶片的生理状态影响叶片的离体再生能力。一般认为叶片正面接触培养基的再生频率高于叶片背面接触培养基的再生频率[16]。本研究发现以凤梨草莓SB-3和SB-8的叶片作为外植体，叶片正面接触培养基的再生率和平均再生芽数均比背面接触培养基的高，与Welande[16]对叶片的研究的相关结果类似。经后续观察发现叶片背面接触培养基产生的再生芽较叶片正面接触培养基产生的再生芽矮小且生长缓慢，是否是由于叶片正面的栅栏组织比叶片背面的栅栏组织对培养基中的营养物质更为敏感所导致[17]，有待进一步验证。

3.2 八倍体凤梨草莓高离体再生能力基因型的筛选

高效离体再生是遗传转化基础[18]。李文然等[19]以苹果属八棱海棠实生种子为试材，建立八棱海棠试管苗无性系，并成功筛选出具有高离体再生能力的基因型，为高效遗传转化体系建立奠定基础。本试验为了得到具有高再生能力的八倍体凤梨草莓基因型，分别从2个方面着手：一是以沈阳农业大学果树细胞工程实验室保存的凤梨草莓优系为试材，进行叶片的离体再生培养，二是以2个凤梨草莓杂交组合种子建立试管苗无性系为试材，进行叶片离体再生培养，最后以2种方式筛选出的具有高离体再生能力的凤梨草莓基因型以及凤梨草莓品种“全明星”为试材，分析比较了它们的离体再生能力。张红梅等[20]以“全明星”叶片为试材进行离体再生，而本试验从更为丰富的基因型中筛选出比“全明星”更高离体再生频率的基因型，说明了此种方法是更加可行的。

随着分子生物学理论和技术的发展，分子育种正成为作物育种的重要发展方向，而草莓已成为蔷薇科果树分子生物学研究的模式植物。基因过量表达和基因沉默是揭示基因功能的重要手段，而这依赖于高效的遗传转化体系。自James等[13]1990年首次获得草莓转基因植株以来，利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法是至今草莓遗传转化的最主要手段。在遗传转化上，尽管草莓的遗传转化研究已开展20多年，但是仍然存在转化效率低的问题，阻碍了转基因技术在草莓上的应用。因此，在建立了二倍体森林草莓和八倍体凤梨草莓高效离体再生体系的基础上进一步筛选出对农杆菌敏感的基因型，建立草莓高效遗传转化体系具有重要意义，为草莓功能基因验证打下基础。

4 结 论

本研究结果表明，不同培养方式下，森林草莓种子发芽率高低顺序依次为：无菌水培养、无激素固体培养基培养和激素固体培养基培养；发芽率随滤纸层数增多而呈下降趋势。森林草莓种质资源RE种子发芽率前期高于YW，成苗速度和质量上两者无明显差异；外植体类型对离体再生不定芽效率具有显著影响，叶片的再生率和平均再生芽数均高于其叶柄。同一种类型的外植体，RE和YW两种基因型在再生效率上无显著差异。筛选出的11-3-2、11-4-2、YA-1、SB-8和SB-9等5种凤梨草莓基因型离体再生能力显著高于“全明星”；且叶片正面接触培养基的外植体不定芽再生率和平均再生芽数均高于背面接触培养基的外植体。

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(责任编辑 汪羽宁)

Seeds Germination and Development of High EfficientinvitroRegeneration System in Strawberry

LI Wen-yan, KONG Fang-nan, WEI You, ZHAO Jing, XU Dong-ying, MA Xian-hua, ZHOU Jing*

(South Asian Tropical Agricultural Science Research Institute of Guangxi, Guangxi Longzhou 532415, China)

Fragariavescawas used as test materials in this study, the effect of the different culture methods on seeds germination and different geno types‘Ruegen’ (RE) and‘Yellow Wonder’ (YW) and different types of explants oninvitroregeneration rates were researched. And in order to optimize theinvitroregeneration system ofF. ×ananassa, the good strains and tube seedling clones ofF. ×ananassawere used as test materials too,invitroregeneration rate of leaf was studied under the same culture conditions, the genotypes ofF. ×ananassawith highinvitroregeneration rates were screened finally, and then they were compared to‘Allstar’.The genotypes with higherinvitroregeneration rates were screened. The results showed that the order from high to low of seeds germination rates by using different cultivation ways were:sterile water cultivation, solid medium adding no hormone cultivation and solid medium adding hormone cultivation. Germination rates gradually descend along with the increased filter layers. Theinvitroadventitious buds regeneration rates were significantly affected by explants types, the regeneration rates and the average numbers of regeneration buds of leaves were higher than the petioles. For the genotype RE, the regeneration rates of adventitious buds of leaves and petioles were 85.0 % and 58.3 % respectively, the average numbers of buds of leaves and petioles were 7.4 and 4.8 respectively. Two genotypes RE and YW had no significant differences in regeneration efficiency. Five genotypes 11-3-2, 11-3-2, YA-1, SB-8 and SB-9 were screened and theinvitroregeneration rates were significantly higher than ‘Allstar’. The regeneration rates and the average numbers of adventitious buds of adaxial blades were higher than the abaxial blades.

Fragariaspp.; Seeds germination;invitroregeneration; High-efficiency; System establishment

1001-4829(2016)10-2463-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.039

2016-07-05

广西壮族自治区直属公益性科研院所基本科研业务费专项项目(GXNYRKS201601)

李文砚(1987-)，女，河北邯郸人，研究实习员，硕士，主要从事热带亚热带果树种质资源研究及开发利用工作，E-mail：liwenyan20100@163.com,*为通讯作者，周 婧，E-mail：823343462@qq.com。

S668.4

A