大蒜叶凝集素基因ASAL的克隆与表达载体的构建

陈德西，何忠全，向运佳，胡荣平

(四川省农业科学院植物保护研究所，农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066)

大蒜叶凝集素基因ASAL的克隆与表达载体的构建

陈德西，何忠全*，向运佳，胡荣平

(四川省农业科学院植物保护研究所，农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066)

大蒜叶凝集素基因(Alliumsativumleaf agglutinin,ASAL)是一种高活性的凝集素基因，且具显著的抗虫性。克隆大蒜ASAL基因将为其在转基因作物中抗虫特性研究奠定基础。本文以GenBank 公布的ASAL基因序列设计特异引物，采用 RT-PCR 法从当地大蒜品种二水早和新都软叶的幼苗中克隆ASAL基因。结果表明，克隆的两个ASAL基因与已知基因的碱基序列相似性分别为98.7 % 和98.9 %，氨基酸序列相似性为98.3 %。将其亚克隆至表达载体中，经菌落 PCR 和酶切鉴定，成功构建了重组质粒。将该载体导入农杆菌EHA5ɑ进行保存。

ASAL基因；刺吸式害虫；基因克隆；表达载体；构建

植物凝集素是来源于植物的一类能凝集细胞和沉淀单糖或多糖复合物的非免疫来源的非酶蛋白质。其研究始1888年，距今已有120多年的历史。1982年Hoffman等[1]克隆出了第一个凝集素基因为菜豆凝集素基因(pha)，目前已经分离出多种如豌豆凝集素 (Pea lectin,PL)、雪花莲凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin,GNA)、麦胚凝集素 (Wheat germ agglutinin,WGA)、半夏凝集素 (Pinellia ternata agglutinin，PTA) 等植物外源凝集素基因[2]。由于植物凝集素对于单糖或糖复合物特异性结合的能力，在信号转导、免疫反应、植物防御等诸多信号过程中均具有重要作用；同时也具有细胞凝集、抗病毒、抗真菌及诱导细胞凋亡或自噬等多种能力，因此在生命科学、医学及农业等诸多方面有较好的研究价值和应用前景。其中在害虫防治方面，植物凝集素具有对鳞翅目、鞘翅目、双翅目特别是对同翅目蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式口器害虫及一些微生物有防效[3-7]，同时具有对环境无污染，稳定性好及对高等动物相对安全等优点，因此，通过转基因技术利用植物凝集素基因来防治病害获得抗性品种已成为研究热点。成功用于植物抗病虫害基因工程的植物凝集素基因有雪花莲凝集素基因、豌豆凝集素基因、麦胚凝集素基因、大蒜叶片凝集素基因等，这些大都为单子叶甘露糖结合凝集素。其中雪花莲外源凝集素、豌豆外源凝集素和大蒜叶片凝集素(ASAL)对哺乳动物的毒性低，对害虫却有极强的抑制作用而倍受青睐。到目前为止，油菜、番茄、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、烟草、马铃薯、大豆和葡萄等多种植物获得了转GNA基因抗虫植株，均表现出一定的抗虫性，该基因在后代中能稳定遗传，符合孟德尔遗传规律。近年来发现ASAL在浓度比GNA低100～400倍时，即0.0025 %(w/v)，即可影响刺吸式口器昆虫的生长和繁殖能力[8]。ASAL对褐飞虱和大叶青蝉致死率高于GNA，在转基因水稻中与对照相比死亡率分别高达83 %和84 %；GNA对白背飞虱更有效果，致死率达90 %[9-11]。

ASAL基因是来自大蒜叶片的一种植物凝集素基因，其包含546 bp 开放阅读框，编码110个氨基酸残基，蛋白分子量为25 kDa，序列与GNA高度相似。ASAL只是中等丰度的蛋白，但通过凝集素与兔血清分析实验表明，ASAL活性比来自大蒜球茎的凝集素ASAI高50倍。大蒜凝集素(ASAL)对人体肿瘤细胞有较强的毒害作用，能强烈抑制肿瘤细胞的生长和DNA合成，并诱发其凋亡，增强人体自身免疫功能。ASAL通过独特的结合昆虫上皮细胞，抑制昆虫中肠营养的摄取，其上的受体细胞也被鉴定出。ASAL凝集素这种受体-配体能力与杀虫剂的特征相关，在昆虫的内脏也十分稳定。ASAL基因在CaMV35S启动下表达的烟草中，检测有2 %总溶解蛋白，转基因烟草减少蚜虫的存活和育性分别为17 %和34 %[12]大大高于转GNA烟草[13]；同样，芥菜蚜虫吃食了转ASAL基因的芥菜植株，死亡率达到89 %，育性减少60 %～64 %[14]；转ASAL基因的水稻使褐飞虱(BPH)死亡率达到36 %和绿叶蝉(GLH)死亡率达到32 %，褐飞虱和绿叶蝉育性分别减少59.5 % 和70.5 %，比转GNA的植株BPH 和 GLH 存活率降低近10 %[15]。

目前，我国转ASAL基因作物报道十分少见，本项目通过克隆并构建该基因的合适的表达载体，以便该基因在转基因作物中广泛应用，提高植物的抗虫性和减少病毒对作物的危害，减少农药的施用量、保护有益昆虫、减轻对环境的污染。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大蒜品种为二水早、新都软叶。克隆载体pMD 20-T购自宝生物；大肠杆菌DH 5a、根癌农杆菌EHA105和植物表达载体Pzh01为本实验室保存。限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq酶购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司,其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取 蒜苗长至3叶1心时，取干净的叶片用铝箔包好，液氮速冻，放-80 ℃保存。大蒜总RNA的提取采用TRIzol试剂进行植物总RNA提取，按试剂盒的说明书进行操作。利用宝生物公司的Kit反转录试剂盒，合成cDNA第一链。

1.2.2ASAL基因克隆 根据已知大蒜的cDNA克隆 (Smeets et al. 1997a[16]，登陆号：No. AY866499)设计引物。上游引物为BamHI-d:5′GGATTCATGG GTCCTACTACTTCATCTCCT3′下游引物EcoRI-d:5′GAATTCTCAAGCAG CACCGGTGCCAACCTT 3′和SacI-d:5′ GAGCTCTCAAGCAGCA CCGGTGCCAACCTT 3′，分别加酶切位点为BamH I、EcoR I和SacI。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。先进行大蒜ASAL基因的CDNA合成，按逆转录试剂盒进行。随后进行PCR反应，体系为： cDNA 2μl，dNTP Mixture 各2.5 mM，正反引物10 μΜ各1μl溶液10×LA PCR Buffer II(Mg2+)5 μl，TaKaRa LATaq(5 U/μl)0.5 μl，用去离子水补足50 μl。PCR扩增程序为94 ℃变性5 min，94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，进行32个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物用1 %琼脂糖凝胶检测。

1.2.3 凝集素基因的克隆及鉴定 扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后，并按DNA凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收纯化，与pMD20-T载体连接，转化至感受态DH5a中，挑取单菌落，在含有X-Gal、IPTG、Amp的琼脂平板培养基上培养37 ℃倒置培养过夜。用载体引物做菌落PCR检测，将阳性转化子送至上海英俊生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 数据处理 采用DNAMAN软件，对所克隆的基因序列进行氨基酸序列比对。

1.2.5 植物表达载体pzH01-ASAL的构建 以测序后的pMD20-T重组质粒和pZH01载体为模板，用EcoR I进行单酶切，利用产物纯化试剂盒纯化后再用BamH I再次进行酶切，电泳后切胶，用胶回收试剂盒回收ASAL基因片段和pZH01载体片段。

将以上2种处理好的回收产物在T4连接酶作用下进行连接并用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后用40 mg/L卡那霉素的LB平板培养筛选单菌落。挑选转化后形成的单菌落，用小量提取试剂盒小量提取质粒，用酶切和PCR检测，得到阳性克隆。并将最终获得的ASAL基因的重组子命名为pzH01-ASAL。通过热激法将其转入农杆菌EHA5ɑ中。

M为DL2000；1和2为大蒜总RNA M:Marker DL2000;1,2:Toltal RNA of garlic leaf图1 大蒜总RNA Fig.1 Total RNA of garlic leaves

2 结果与分析

2.1 总RNA质量检测

提取总RNA之后，经分光光度计和凝胶电泳分析，总RNA电泳检测(图1)所示，从图1可以看出，28SrRNA和18SrRNA条带清晰，总RNA纯度较高而且没有发生严重降解。可用于RT-PCR实验。根据大蒜ASAL cDNA序列合成的引物PCR反应后得到一段长约560 bp的DNA片段，如图2所示。

2.2 目的基因片段的克隆与测序

RT-PCR产物切胶回收后，将目的片段连接到PMDTM-20载体上，以重组质粒为模板，以特异性序列为引物经PCR扩增可得一条长约560 bp的片段，表明PMD-ASAL中有完整的ASAL片段。经过测序，发现其与Genebank中报道的大蒜ASAL基因比对结果发现二水早和新都软叶的碱基序列同源性达到99.8 %，而与NCBI数据库提交的ASAL碱基序列的相似性分别为98.7 % 和98.9 %(图3)，氨基酸序列比对结果表明二水早和新都软叶的氨基酸相似性达到100 %，与已知ASAL氨基酸的相似性达到98.3 %，主要的不同体现在第33位的氨基酸由已知的缬氨酸变为亮氨酸，第168位的赖氨酸变为天冬酰胺，第169位的天冬氨酸变为缬氨酸。基因的cDNA序列同源性为98.64 %(图4)。

M为DL2000；1,5为RT-PCR扩增的片段M：DL2000;1,5:The amplified RT-PCR fragments图2 RT-PCR 的ASAL产物Fig.2 RT-PCR product of ASAL by agarose gel electrophoresis

图3 已知ASAL基因序列与大蒜二水早和新都软叶的ASAL DNA序列比对Fig.3 Known ASAL gene DNA sequence alignment with the ASAL gene from the Ershuizao and Xindu soft leaf

图4 已知ASAL蛋白与大蒜二水早和新都软叶的ASAL氨基酸序列比对Fig.4 Comparison of the known amino acid sequences with the cloned ASAL sequences from the Ershuizao and Xindu soft leaf

2.3 构建植物表达载体pzH01-ASAL

选择常用的植物表达载体pzH01，首先用EcoR I和BamH I切除其GUS基因(图5)，然后用已获得的ASAL基因的cDNA片段进行替换，最终构建出一个以CaMV35S启动子调控的ASAL基因的植物表达载体pzH01-ASAL(图6)，酶切鉴定。

3 讨 论

害虫是造成农林业减产的重要因素之一，过多的喷施化学农药不仅会造成环境污染，且害虫及容易产生抗性。生物杀虫剂成本较高，见效慢。转基因抗病虫作物的出现为人们防治植物病虫害开拓了新的思路。植物凝集素对鳞翅目特别是同翅目蚜虫、飞虱、叶蝉等刺吸式口器害虫及一些微生物有明显的致死作用，减少虫传病毒且具有对环境无污染、稳定性好及对高等动物相对安全等优点，成为目前的重要研究对象。

大蒜RNA的提取较水稻和玉米等禾本科植物的提取棘手，因为里面含有大量的蛋白和多糖，叶片细胞破粹后，多糖会与RNA提取时所用变性剂形成难溶的胶状物与RNA共沉淀，而且多糖会抑制许多酶的活性，不利于后续分子生物学实验。我们试过的几种试剂盒包括Total RNA提取试剂(TaKaRa RNAiso Reagent)、BIOROL Reagent和TRIZOL Reagent, 效果都不理想，都存在沉降过程中有难溶的胶状物与RNA共沉淀。后来针对TotalRNA提取试剂配合使用去除多糖的RNAiso PLUS，仍然有难溶的胶状物与RNA共沉淀。利用TRIZOL Reagent提取3叶1心的大蒜叶片并改进了沉降方法，即加糖原后由异丙醇和RNA沉降剂沉降，提取效果大为改观，质量才能满足后续实验。因此在大蒜叶片RNA提取应该采用幼嫩叶片和合适的RNA沉降方法，才能获得好的提取效果。

M为DL2000;1为未切的质粒;2～9为已切开的质粒M:Maker DL2000;1 was not digested by enzyme;2-9 were the digested plasmids 图5 载体PZH01被BamH I和EcoR I双切Fig.5 Vector PZH01 was digested by enzyme BamH I and EcoR I

图6 pzH01-ASAL的表达载体图谱Fig.6 Expression vector map of pzH01-ASAL

在大蒜ASAL基因的克隆过程中，笔者至少设计了8对引物，多数扩增的效果不理想，为多条带。后来通过加酶切位点，PCR的扩增效果才得以改善。本研究构建了含ASAL基因的植物表达载体Pzh01-ASAL，其含有 CaMV35S 启动子、ASAL基因、终止子表达单元和一个 CaMV35S 启动子驱动的HPT筛选基因。近年来，许多凝集素基因的成功克隆及成功转至水稻，小麦，玉米等作物中，培育出了新的抗虫植株，突显了凝集素蛋白在作物育种方面重要的应用价值[16]。本研究对我国大蒜本土品种的大蒜凝集素基因进行克隆，并构建了其植物表达载体，为深入研究大蒜叶凝集素的功能和进一步进行抗虫基因转化奠定了定了基础。

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(责任编辑 陈 虹)

Cloning ofASALGene and Construction of Its Plant Expression Vector

CHEN De-xi, HE Zhong-quan*, XIANG Yun-jia, HU Rong-ping

(Institute of Plant Proteciton, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest,Minsitry of Agriculture,Sichuan Chengdu 610066,China)

ASALgene was a highly active gene in many plants and had high insect resistance. CloningASALgene isolated from garlic would lay the foundation for transgenic crops characteristic research in insect resistance. In this paper, a pair of specific primers was designed according to the sequence ofASALgene in GenBank, and using the total RNA of garlic seedlings of the local varieties Eershuizao and Xindu soft leaves as the templates, the complete cDNA sequences by RT-PCR were obtained. The results showed that the recombinant plasmids containingASALgene from Eershuizao and Xindu were similar to reach 98.7 % and 98.9 % respectively withASALgene in GenBank and the amino acid sequences were similar to reach 98.3 % .The recombinant plasmids were successfully constructed by PCR amplification and digestion with restriction endonucleases. The vectors were transformed into theAgrobactriumtumefaciensEHA5ɑ for preservation．

ASALgene; Sucking pest; Gene cloning；Plant expression vector; Construction

1001-4829(2016)10-2445-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.036

2015-09-15

国家科技支撑计划西南稻区水稻重大病虫防控技术研究与集成示范(2012BAD19B03-09)；四川省财政基因工程优秀论文基金项目(2011LWJJ-005)

陈德西(1977-)，女，四川大竹人，副研究员，主要从事植物分子病理研究，*为通讯作者,E-mail:zhquhe6868@sina.com。

S633.4

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