超声提取广西白木香叶黄酮的工艺研究

黄惠芳，王丽萍，黄秋伟，檀小辉，曾黎明

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

超声提取广西白木香叶黄酮的工艺研究

黄惠芳，王丽萍，黄秋伟，檀小辉，曾黎明

(广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001)

探讨白木香叶中黄酮的提取工艺，以广西白木香叶为原料，通过单因素试验，研究不同提取时间、超声功率、乙醇浓度以及料液比对白木香叶黄酮提取率的影响，并采用正交试验优化超声提取白木香叶黄酮的工艺条件参数。结果表明，超声提取白木香叶黄酮的最佳工艺条件为提取时间25 min 、超声功率250 W、乙醇浓度80 %、料液比1∶40，在此条件下提取率为6.3096 %；超声提取工艺优于常规提取工艺。

超声提取；白木香叶；黄酮

白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng)] 是沉香属瑞香科的植物，别称沉香、土沉香、牙香树等，是中国珍贵药用植物，分布在我国海南、广东、广西、云南、福建等地区。白木香生长过程中受外界刺激会局部形成含黑色树脂的树材，可以入药，是国产中药沉香的唯一资源[1-2]。白木香叶为沉香的非药用部分，白木香叶醇提取物具有镇痛、抗炎、平喘、促进小肠运动、泻下、止血、抗脑缺血缺氧、降血糖、抗肿瘤等活性[3-5]；同时，白木香叶茶具有理胃气、润肠通便、安神助眠、益气益精等保健功效[6]。广西是白木香的重要产区，白木香的生理生化特性会因地区有差异，这种差异不仅表现在沉香的品质上，白木香叶中的活性成分含量也会因地理区域、气候土质条件而表现出差异。白木香叶黄酮超声提取工艺研究未见有相关报道，对广西白木香叶黄酮的研究亦未见有研究报道。

植物中黄酮的提取方法常用的有回流加热提取法、常规溶剂浸提法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。超声提取在中草药有效成分提取工艺中具有提取率高、提取时间短和低温提取有利于保护有效成分等简单高效的优点而被广泛使用[7-9]，采用单因素实验与正交试验研究超声提取广西白木香叶黄酮的最佳工艺，并采用AlC13比色法测定广西白木香叶中黄酮含量，为白木香叶开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白木香叶采自广西灵山县武利镇沉香种植基地。白木香叶于50 ℃恒温鼓风干燥箱中干燥，粉碎，过40目筛，得白木香叶干粉，用于提取白木香叶黄酮。乙醇、氯化铝、乙酸钠采用国产分析纯试剂，芦丁：上海绿叶生物科技有限公司生产。

1.2 仪器与设备

超声波细胞粉碎机KBS-250(江苏昆山市超声仪器有限公司)，电子天平GR200(日本A&D有限公司)，FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；低速冷冻离心机DL-6000B(上海安亭科学仪器厂)，Lambda35紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 白木香叶黄酮提取方法 取粉碎后的沉香叶干粉，放进50 mL圆底玻璃离心管中，加入提取溶剂，置于超声波粉碎仪中，离心管下部套入冷水浴中，设定超声工作模式为超声5 s，间歇5 s，设定超声工作时间及超声功率，超声结束后取出冷水冷却，6000 r/min冷冻离心20 min。取上清液，用60 %乙醇稀释至适当浓度，于420 nm波长下测定吸收度，计算黄酮含量。

1.3.2 沉香叶黄酮的测定 采用AlC13比色法测定黄酮，黄酮类化合物的甲醇(或乙醇)溶液中加入三氯化铝试剂时，能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物，导致光谱发生变化[10-11]。沉香叶中黄酮主要包括洋芹素-7，4，-二甲醚、木犀草素-7，3，4-三甲醚、 木犀草素-7，4，-二甲醚、芫花素、木犀草素、羟基芫花素等[5,12]，具有4-羰基和5-羟基结构，因此，本研究采用丁明玉等[13]的AlC13比色法分析白木香叶黄酮含量。取1 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1 mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇定容至刻度，空白对照中加入同样体积的反应液，不足部分以60 %乙醇补足，摇匀后于室温下反应20 min，以芦丁为标准品，在420 nm 处测定吸收度，通过回归方程计算样品中黄酮含量，从而计算出样品中黄酮百分含量，计算公式如下：

式中，C：提取液中黄酮含量(mg)，V1：总样品体积(mL)，W：样品重量(g)，V2：测定样品体积(mL)，N：稀释倍数。

1.3.3 标准曲线的绘制 精密称取芦丁标准品 20 mg，置 100 mL容量瓶中，用60 %乙醇定容至刻度，摇匀，作为标准液。精密吸取标准液0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL 分别置 10 mL容量瓶中，分别加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇稀释至刻度，空白对照加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液、3 mL 1mol/L NaAc溶液和60 %乙醇5 mL，在室温下反应20 min，于420 nm 波长处测定吸收度(OD420)。

1.3.4 乙醇浓度对白木香叶提取率的影响 准确称取1.0 g粉碎后的白木香叶干粉，放进50 mL圆底玻璃离心管中，加入不同浓度乙醇30 mL，试验不同乙醇浓度对白木香叶黄酮提取率的影响，乙醇浓度为50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %，超声提取15 min，超声功率250 W。冷冻离心后取上清液测定OD420，计算样品中黄酮含量。

1.3.5 提取时间对白木香叶黄酮提取率的影响 准确称取1.0 g粉碎后的白木香叶干粉，放进50 mL圆底玻璃离心管中，加入80 %乙醇30 mL，试验不同超声提取时间对沉香叶黄酮提取率的影响，超声提取时间分别为5、10、15、20和25 min，超声功率250 W。冷冻离心后取上清液测定OD420，计算样品中黄酮含量。

1.3.6 超声功率对白木香叶黄酮提取率的影响 准确称取1.0 g粉碎后的白木香叶干粉，放进50 mL圆底玻璃离心管中，加入80 %乙醇30 mL，超声提取15 min，试验不同超声提取功率对白木香叶黄酮提取率的影响，超声功率分别为50、100、150、200和250 W。冷冻离心后取上清液测定OD420，计算样品黄酮含量。

1.3.7 料液比对白木香叶黄酮提取率的影响 准确称取1.0 g粉碎后的白木香叶干粉，放进50 mL圆底玻璃离心管中，加入不同倍数的80 %乙醇，试验不同倍数溶剂对白木香叶黄酮提取率的影响，80 %乙醇用量分别为20、25、30、35和40倍。超声提取15 min，冷冻离心后取上清液测定OD420，通过回归方程计算样品中黄酮含量。

1.3.8 正交试验设计 在单因素实验的基础上，选取乙醇浓度(A)、提取时间(B)、超声功率(C)以及溶剂倍数(D)进行四因素三水平的正交试验，因素水平设定如表1所示。

1.4 统计分析

数据采用Excel 2010进行数据分析、制图，采用正交试验助手对数据进行直观分析及正交试验方差分析，同时采用SPSS 17.0软件进行差异显著性检验(Duncan’s新复极差法)。

表1 正交试验设计因素与水平

2 结果与分析

2.1 黄酮标准曲线

以OD420为横坐标，芦丁标准品浓度为纵坐标作图，得回归方程为：y=0.3304x+0.0084，R2=0.9991。

2.2 超声提取时间对白木香叶黄酮提取率的影响

超声提取时间在5～25 min时，白木香叶黄酮提取率逐渐增大，5～10 min增幅十分明显，提取时间增加到30 min时，提取率有所下降(图1)。这是由于提取刚开始时，超声波对细胞壁的破碎不充分，细胞内黄酮没有充分溶解在溶液中，提取时间达到10 min后，细胞中的黄酮基本解离出来。进一步延长超声提取时间，黄酮提取率增加幅度逐渐趋于稳定，至30 min时提取率略有降低，可能是超声时间过长导致溶出的有效成分被分解所致。在实际生产中，增加超声提取时间会延长生产周期，增加生产能源消耗，提高生产成本，还可能引起活性成分被氧化分解，从而导致提取率降低、产品收率降低，最终降低产品品质。

2.3 乙醇浓度对白木香叶黄酮提取率的影响

在乙醇浓度为50 %～80 %时，随着乙醇浓度提高，白木香叶黄酮提取率逐渐提高，超过80 %，进一步提高乙醇浓度，黄酮提取率下降(图2)。这是因为醇-水浓度变化会引起溶剂极性的变化，从而导致黄酮类物质的溶解率也发生变化，且过高乙醇浓度容易引起蛋白质凝聚作用，滞留在颗粒内部孔道中，使组织的微孔堵塞，增加了黄酮类化合物扩散的阻力，同时水分减少也削弱了对细胞的溶胀能力。因此乙醇浓度增加到一定程度，黄酮溶出率会反而减少，提取率降低。

图1 超声提取时间对黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on extraction yield of flavonoids

2.4 超声提取功率对白木香叶黄酮提取率的影响

超声功率在50～200 W时，白木香叶黄酮提取率也逐渐提高(图3)。其原因在于超声功率过低，细胞破碎率不足，黄酮溶出不充分，导致提取率偏低，而随着超声功率的提高，细胞破碎完全，黄酮已基本溶出，提取率趋于稳定。

2.5 料液比对白木香叶黄酮提取率的影响

当提取溶剂在1∶20～1∶30倍时，随着溶剂用量的增加，黄酮的提取率明显增加(图4)。这是因为溶剂的用量越大，黄酮溶解越充分，提取率就越高。当提取溶剂为30倍之后提取率的增加速率趋于平缓。这是因为当溶剂的用量达到一定程度时，溶剂已将有效成分基本溶出，使得率趋于稳定，即使增加溶剂用量，黄酮提取率也不会有明显变化。同时，溶剂用量的增加，会导致生产成本增大，也会增加后续浓缩工艺的能耗成本。

图2 乙醇浓度对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

图3 超声提取功率对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction power on extraction yield of flavonoids

图4 料液比对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of flavonoids

2.6 正交试验优化超声提取工艺

为全面研究超声提取白木香叶黄酮各因素对白木香叶黄酮提取率的的影响，在单因素试验结果的基础上设计了正交试验对提取工艺进行优化，以确定白木香叶黄酮提取的最佳工艺条件。

由表2～3可以看出，在实验选定因素水平范围内，选择的4个因素对白木香叶黄酮提取率的影响程度由大到小依次为A乙醇浓度﹥C超声功率﹥D料液比﹥B超声时间，且4个因素对白木香叶黄酮提取率的影响均不显著(α=0.05)。由于A因素，均值K2>K1>K3；B因素，均值K3>K2>K1；C因素，均值K3>K2>K1；D因素，K3>K2>K1；所以得出超声提取白木香叶黄酮的最佳工艺参数组合为A2B3C3D3，即乙醇浓度80 %，超声提取时间25 min，超声提取功率250 W，料液比1∶40。

2.7 验证及对比实验

为了验证工艺组合A2B3C3D3是否最佳，故确定乙醇浓度80 %，超声提取时间25 min，超声提取功率250 W，料液比1∶40，在此条件下对白木香叶黄酮进行3次超声萃取，提取率分别为6.3059 %、6.2894 %和6.3334 %，平均提取率为6.3096 %。此结果大于正交试验任意组提取率，说明正交试验结果可靠，即工艺组合A2B3C3D3为最佳工艺条件。为了比较超声提取工艺与常规提取工艺，采用以下两种常规方式提白木香叶黄酮：①室温下在白木香叶粉中加入40倍80 %乙醇浸提24 h，重复3次，黄酮提取率为(5.6508±0.0458) %；②在白木香叶粉中加入40倍80 %乙醇，在热水浴中回流提取1.5 h,重复3次，黄酮提取率为(5.5003±0.0191) %。两种常规工艺黄酮提取率均低于超声提取白木香叶黄酮的提取率。

表2 正交实验结果及直观分析

表3 方差分析

3 讨论与结论

本研究在超声提取广西白木香叶黄酮的单因素试验中：①试验选取超声提取时间为5～30 min，在5～25 min时，沉香叶黄酮提取率逐渐增大，5～10min增幅十分明显，提取时间增加到30 min时，提取率有所下降；②在乙醇浓度为50 %～80 %范围内，随着乙醇浓度提高，沉香叶黄酮提取率逐渐提高，进一步提高乙醇浓度，乙醇浓度在80 %～100 %范围内，黄酮提取率下降；③超声提取功率在50～200W范围，白木香叶黄酮提取率随功率增加也逐渐提高，并趋于稳定；④当料液比为1∶20～1∶30倍时，随着溶剂用量的增加，黄酮的提取率明显增加，当提取溶剂30倍之后提取率的增加速率趋于平缓。在正交试验中，在实验选定因素水平范围内，选择的四个因素对白木香叶黄酮提取率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度﹥超声功率﹥料液比﹥超声时间；且四个因素对白木香叶黄酮提取率的影响均不显著。正交试验最佳工艺参数条件下(乙醇浓度80 %，超声提取时间25 min，超声提取功率250W，料液比1∶40)，超声提取广西白木香叶黄酮的平均提取率为6.3096 %，均高于两种常规工艺黄酮提取率。

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(责任编辑 王冠玉)

Ultrasonic Extraction Technology of Flavonoids from Leaves ofAquilariasinensisin Guangxi

HUANG Hui-fang, WANG Li-ping, HUANG Qiu-wei, TAN Xiao-hui, ZENG Li-ming

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

In order to study extraction technology of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensis, the influence of different extraction time, ultrasonic power, concentrations of ethanol and material to liquid radio on flavonoids extraction yield was evaluated using single-factor experiment method with leaves ofAquilariasinensisin Guangxi as raw materials. Then the orthogonal experimental design was used to optimize ultrasonic extraction parameters. The results showed that the best conditions for ultrasonic extraction of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensiswere as follows:extraction time of 25 min, ultrasonic power of 250W, ethanol concentration of 80 % and material to liquid ratio of 1∶40. The yield of flavonoids was 6.3096 % under the best conditions. The ultrasonic extraction process is superior to the conventional extraction.

Ultrasound extraction; Leaves ofAquilariasinensis；Flavonoids

1001-4829(2016)10-2366-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.021

2016-04-01

广西亚热带作物研究所专项资金项目(桂热研201304，桂热研201408)

黄惠芳(1969-)，女，广西博白人，研究员，主要从事天然产物研究， E-mail：hhuif@126.com。

S567.19

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