贵州马铃薯推广品种SSR分子标记及遗传多样性分析

颜 谦，滕安平，李恩宏，杨 建，施文娟，黄先群*

(1.贵州省马铃薯研究所/贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；2.贵州省种子管理站，贵州 贵阳 550002)

贵州马铃薯推广品种SSR分子标记及遗传多样性分析

颜 谦1，滕安平2，李恩宏2，杨 建1，施文娟2，黄先群1*

(1.贵州省马铃薯研究所/贵州省农业生物技术重点实验室，贵州 贵阳 550006；2.贵州省种子管理站，贵州 贵阳 550002)

为了鉴定马铃薯品种的亲缘关系，采用10对SSR分子标记引物，对19份贵州马铃薯生产品种进行SSR分子标记及遗传多样性分析。结果表明：10对SSR引物中5对获得60条清晰条带，其中49条为多态性条带，多态性比率为81.67﹪，平均每个引物的多态性条带数为9.80条。19份马铃薯品种的遗传相似性系数为0.43～1.00。经聚类分析，在遗传相似系数为0.56处全部参试材料聚在一起，在遗传相似系数为0.63处可明显聚为3个类群。第Ⅰ类群包括11份材料，第Ⅱ类群包括7份材料，第Ⅲ类群只有1个材料。在相似性系数0.65处，57.89 %的参加品种聚在一起，表明参试品种的遗传背景较为狭窄。

马铃薯；品种；SSR标记；遗传多样性

马铃薯是贵州省的重要粮食、饲料、菜用和加工原料作物。贵州马铃薯种植面积和产量多年来居全国前列。近年来，随着贵州省马铃薯育种进程加快，育成品种数量增加。优良品种是作物高产的基础，品种混杂和纯度降低会明显降低产量，影响产品质量和商品价值，快速准确地鉴定品种和进行纯度分析对于种子质量标准化、品种审定、假种辨别和产权纠纷等具有重要意义。传统的品种鉴定一般采用形态学标记方法，往往鉴定周期长，存在较大的误差，一些性状差异小的品种间鉴定困难。为了解各品种间的亲缘关系和遗传背景、规范马铃薯的分类管理、保证品种纯度、保障马铃薯产业的利益，有必要对马铃薯生产品种进行分子标记指纹图谱分析，也为今后马铃薯品种选育的亲本选择、杂交组配、杂种优势预测提供分子水平的理论依据。

微卫星(simple sequence repeat，SSR)标记具有共显性，重复性好，多态性高，扩增结果稳定，检测手段简便易行等特点，被广泛应用于马铃薯品种指纹图谱构建、遗传关系分析、品种鉴定、多态性检测等。目前，利用SSR标记对马铃薯品种和材料进行多态性鉴定和检测的报道已有许多。在遗传多样性分析方面，Norero等[1]和Moisan-Thiery等[2]利用SSR引物分别区分36个和286个马铃薯品种；段艳凤等[3]等利用10对SSR引物构建中国2000-2007年审定的88个马铃薯品种的指纹图谱并进行遗传多样性分析；李先平等[4-5]利用SSR引物分别鉴定30份和50份彩色马铃薯品种；唐铭霞等[6-7]利用SSR分子标记分别对42份和36份马铃薯品种多态性进行分析；甘晓燕等[8]利用SSR和SRAP 2种分子标记对宁夏地区47份主要马铃薯种质材料进行遗传多样性分析；黄团等[9]利用10对SSR引物对紫色马铃薯品种黑美人60Co-γ射线辐射材料进行DNA检测并获得了多态性条带。在马铃薯品种纯度鉴定方面，谢春梅等[10]应用9对SSR引物鉴定马铃薯杂交实生种子的纯度；于卓等[11]利用SSR分子标记技术鉴定马铃薯F1杂种。上述研究表明，SSR分子标记已成为马铃薯遗传多样性分析和品种纯度鉴定的常规技术和手段。因此，为了鉴定贵州省农业委员会提供的20个马铃薯生产品种(系)之间的遗传背景和亲缘关系，本研究利用段艳凤等[3]从138对SSR引物中筛选出的10对多态性高、条带清晰的引物对参试材料进行遗传多样性分析，以期为马铃薯品种的开发与利用、种质资源的管理、品种产权保护等方面提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2014年取分析样本20个，每份2个种薯，发芽程度不一，最长的可达10～15 mm，有5个处理未发芽(表1)，有1个材料J20140807(为简便仅以后面4位数代替，如J20140807简称为0807，下同)的2个种薯中仅1个萌发出芽。将所有未萌芽的种薯用10 mg/L浓度的GA3浸种10 min进行催芽。由于一些种薯的休眠期难以打破，催芽时间较长，种薯较长时间处于高温高湿环境，个别种薯有腐烂现象，如0946 (洋人洋盘县1，前为品种名称，后为育种单位简称)未获得植株不进行 DNA检测结果。

表1 参试的马铃薯品种(系)名称及种薯性状

注：品种后括号为育种单位简称，金龙为贵州金龙马铃薯有限公司，威宁1为威宁县南方马铃薯专业合作社，威宁2为威宁县泰丰科技实业有限责任公司，盘县1为盘县四格坡上马铃薯专业合作社，盘县2为盘县农科所；扶贫：贵州省扶贫开发技术指导中心，遵义为遵义县华富农业生物科技有限公司，思南为思南县华丰果蔬专业合作社，安顺为安顺市农业科学院，水城为水城县大山种业有限公司。

表2 试验所用的SSR引物名称和序列

1.2 播种

试验于2014年10月中旬播种。将灭菌后的混合土壤装盆浸润，直接将发芽马铃薯块茎种入土壤中，播种完毕后置于实验室阳台上自然条件下培养。每3～5 d浇水1次，待长出叶片后施以少量复合肥。

1.3 分子标记引物

试验选用引物是段艳凤等[3]在鉴定中国88个马铃薯审定品种时从138对SSR引物中筛选的10对多态性高、谱带清晰的引物(表2)，引物由上海捷瑞公司合成。

1.4 DNA提取及检测

参试品种播种后，由于栽种的种薯部分死亡，后来又补种。播种45 d后开始提取DNA。剪取苗期各参试品种幼嫩健壮叶片各约100 mg置于2 mL离心管中，直接加入液氮快速冷冻。采用快捷型植物基因组DNA提取系统(Tiangen公司生产)提取马铃薯供试品种的基因组DNA，操作程序按说明书进行。用1.0 %琼脂糖凝胶检测其完整性。

1.5 SSR-PCR扩增

20 μl SSR-PCR反应体系参见黄团等[12]的报道。SSR-PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸42 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR产物用15 %的变性PAGE电泳进行检测。

1.6 数据统计分析

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳所得的谱带采用0/1系统记录，有条带记为1，无条带记为0，得到原始矩阵。多态性位点百分p=(k/n)×100 %，式中，k为多态性位点条带数，n为所测总条带数。使用NTSYS-pc2.10e软件计算试验材料间的遗传距离，并用软件中Qualitative Date计算遗传相似系数，非加权平均法(UPGMA)进行聚类分析，通过TreeP lot模块构建树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 参试品种的多态性

对19份马铃薯样品进行PCR扩增，10对SSR引物中仅有5对获得清晰可读条带(图1)，分别是S170、S151、S184、S118、S25共获得60条DNA条带，其中49条为多样性条带，多态比率是81.67 %，平均每个引物的多态性条带数为9.8条。

2.2 参试品种的遗传相似性

从表3看出，19份马铃薯参试品种的遗传相似系数为0.49～1.00。相似性系数≥0.90以上(含0.90)的品种：0602(黑美人金龙)与0603(黑美人威宁1)之间的遗传相似系数为1.00，是参试材料中相似系数最大的组合；0611(费乌瑞它威宁1)与0613(费乌瑞它威宁1)之间、0803(黑美人思南)与0805(黑美人思南)之间的相似性系数均为0.94；0803(黑美人思南)与0602(黑美人金龙)、0603(黑美人威宁1)的相似性系数均为0.90；0807(费乌瑞它安顺)与0611(费乌瑞它威宁1)、0613(费乌瑞它威宁1)的相似性系数分别为0.92和0.90；0909(费乌瑞它遵义)与0611(费乌瑞它威宁1)和0807(费乌瑞它安顺)的相似性系数分别为0.90和0.98。表明，这些品种之间的遗传背景差异小，亲缘关系很近。

图1 引物S170对19份参试马铃薯品种的扩增Fig.1 Amplified results of primer S170 to 19 test potato varieties

表3 19份马铃薯供试品种的遗传相似性Table 3 Genetic similarity coefficients of 19 test potato varieties

有部分品种的相似性系数在0.50以下，如0928(威芋5号威宁2)与0909(费乌瑞它遵义)、0715(云师特遵义)的遗传相似性分别为0.43和0.49；0702(青薯9号盘县1)与0709(费乌瑞它扶贫)的相似性系数为0.49；0806(中薯3号安顺)与0709(费乌瑞它扶贫)和0715(云师特遵义)的遗传相似性分别为0.43和0.47。表明，这些品种的遗传亲缘关系较远。

2.3 参试品种的遗传聚类图

从图2可知，19份供试品种在遗传相似系数为0.63处可明显聚为3类。第Ⅰ类群包括11个品种，第Ⅱ类群包括7个品种，第Ⅲ类群只有1个品种。第Ⅰ类群在遗传相似系数为0.78时可分为Ⅰ-A和Ⅰ-B﹑Ⅰ-C 3个亚簇。I-A亚簇包括3个子亚簇I-A-1、I-A-2、I-A-3，共7个品种。子亚簇I-A-1包含0601(青薯9号金龙)和0920(盘薯4号盘县2)2个马铃薯品种。从种薯表型看，均是红皮黄肉，圆形；0602(黑美人金龙)、0603(黑美人威宁1)、0803(黑美人思南)、0805(黑美人思南)子亚簇I-A-2包含4个马铃薯品种，这4个品种均为黑美人；从种薯表型看，均是紫皮紫肉，长形；子亚簇I-A-3只有0945(洋人洋盘县)1个品种，红皮白肉，长形。Ⅰ-B亚簇有3个品种0617(青薯9号威宁1)、0702(青薯9号盘县1)、0806(中薯3号安顺)，均是黄色薯肉，0617、0702为红皮，遗传关系较近，0806黄皮，遗传关系相对较远。Ⅰ-C亚簇仅为1个材料0929(宣薯2号威宁)，黄皮黄肉，椭圆形。

在第Ⅱ类群的7个品种中，0611(费乌瑞它威宁1)与0613(费乌瑞它威宁1)、0807(费乌瑞它安顺)与0909(费乌瑞它遵义)亲缘关系很近，薯皮薯肉均为黄色；其他3个品种0916(乌洋芋水城)、0709(费乌瑞它扶贫)、0715(云师特遵义)亲缘关系相对较远，0916(乌洋芋水城)红皮白肉，0715(云师特遵义)皮为紫色，肉为白色带星点紫色。第Ⅲ类群只有1个品种0928(威芋5号威宁2)，黄皮黄肉，这个类群与其他类群间的遗传距离较大，表明与其他品种存在一定差异，亲缘关系较远。总体来说，参试马铃薯品种分子标记结果，与马铃薯品种种薯间的性状有相关性和一致性。

3 结 论

(1)王绍鹏等[13]利用4对引物对黑龙江省7个主栽品种进行SSR标记，共获得144条多态性条带，平均每对引物扩增出36条特异性条带。SSR 标记试验重复性好，结果稳定可靠，可作为马铃薯品种纯度鉴定的方法在实践中应用。本次试验采用段艳凤等[3]从138对SSR引物中筛选出的10对多态性高、谱带清晰的引物，大部分参试材料均可被分开，说明采用SSR标记构建马铃薯品种DNA指纹图谱鉴定可行，这有助于马铃薯遗传资源的进一步挖掘和利用，能对马铃薯新品种的鉴定、管理和保护提供一定参考依据。

图2 19份马铃薯品种的SSR遗传聚类图Fig.2 Dendrogram of 19 potato varieties based on SSR marker

(2)从聚类图结果看，参试4个不同来源的黑美人品种聚在一起，在参试5个不同来源的费乌瑞它品种中，除扶贫办提供的品种相距稍远一些，其余4个相距在一起；青薯9号的情况也类似，3个参试的、不同来源的青薯9号，2个聚在一起。由此可见，参试品种分子标记结果与马铃薯品种的性状有相关性和一致性。而同一品种不能相距在一起，原因其一可能是马铃薯是块茎繁殖，其杂合性高，在生产中易产生芽变而导致不同；其二样品量太少(1～2个)，所取样品难以代表整个品种，因此还要结合表型进一步判别。

(3)段艳凤等[3]的研究表明，在相似系数0.62处，88个供试马铃薯材料被聚为一类，从分子水平上表明供试材料遗传基础非常狭窄。唐铭霞等[6]对42份马铃薯试验材料的遗传聚类分析表明，在遗传相似系数0.64 处，42份马铃薯材料聚在一起，显示四川省栽培的马铃薯品种遗传多样性水平较低，品种间的遗传差异较小。李飞等[14]研究结果表明，在相似系数0.61处，参试的8个马铃薯品种(系)中7个品种(系)聚在一类，从分子水平上表明，供试材料的遗传基础较狭窄。李丽等[15]利用1O对SSR引物对38份贵州马铃薯审定品种和2012年区试材料进行遗传多样性分析表明，在遗传相似系数0.61处，所有参试材料可明显分为3个类群，贵州马铃薯不同品种间遗传基础较狭窄，同一单位育出的材料往往优先聚为一类。黄先群等[16]利用9对SSR引物对引进品种和变异材料进行遗传多样性分析表明，24份参试材料在遗传相似系数为0.65处可明显分为4个类群，全部变异材料均聚在1个类群，品种间的多态性和遗传距离大于变异材料。本试验结果与上述研究结论基本一致，即从分子水平上表明国内品种间的遗传差异较小，遗传基础非常狭窄；同一品种或同一单位育成的品种亲缘关系近。在今后育种工作中，应选择遗传差异丰富的亲本进行杂交，为拓宽遗传基础、丰富马铃薯种质资源和培育新品种奠定基础。

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(责任编辑 刘忠丽)

Genetic Diversity Analysis of Guizhou Potato Production Varieties by SSR Molecular Marker

YAN Qian1, TENG An-ping2, LI En-hong2, YANG Jian1, SHI Wen-juan2, HUANG Xian-qun1*

(1. Guizhou Institute of Potato/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Guizhou Guiyang 550006,China; 2. Seed Management Stations in Guizhou, Guizhou Guiyang 550002, China)

In order to identify the genetic relationship of potato varieties, the 19 potato production varieties in Guizhou were used to analyze the genetic diversity by 10 SSR molecular marker primers. The results showed that only 5 of the 10 SSR primers were obtained clear and readable bands by the PCR amplification. The 60 DNA bands were obtained, including 49 polymorphic bands with a polymorphism rate of 81.67 %, number of polymorphic bands per primer was 9.80. The genetic similarity coefficients of the 19 potato varieties were from 0.43 to 1.00. UPGMA cluster analysis showed that all tested varieties were got together in similarity coefficient 0.56. They were divided obviously into three groups in the genetic similarity coefficient 0.63. The group I included 11 varieties, the groupⅡ included 7 varieties, and group III only one variety. There were 57.89 % of the tested varieties still gathering together in the similarity coefficient 0.65. It meant that the genetic background of all tested varieties is relatively narrow.

Potato; Variety; SSR marker; Genetic diversity

1001-4829(2016)10-2294-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.008

2015-12-15

贵州省级财政马铃薯发展资金项目“贵州省中药现代化专项‘葛根良种鉴选、规范化苗圃及示范体系建设’”[黔科合成字2013(5013)]

颜 谦(1965-)，男，高级实验师，从事薯类脱毒及种薯繁育研究，E-mail:2711475258@qq.com，*为通讯作者：黄先群(1958-)，女，研究员，博士，从事农作物生物技术工作,E-mail:xqhuang2005@163.com。

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